食物特异性IgA抗体与儿童过敏性紫癜的相关性研究

发布时间：2020-11-13 15:22

　　 过敏性紫癜(Henoch-Sch(?)nlein purpura,HSP)是一种以小血管为主要病变的III型变态反应性疾病,是免疫复合物介导的白细胞碎裂性血管炎。因病理上以Ig A沉积于受累毛细血管及小血管为特征,2012 International Chapel Hill Consensus Conference(CHCC2012)新的血管炎分类标准将HSP更名为Ig A血管炎,分类上隶属于小血管炎下的免疫复合物性血管炎[1]。HSP常累及皮肤、关节、消化道、肾脏,其中又以肾脏受累的病情最为严重。HSP是儿童最常见的血管炎,发病率逐年增加,病因和发病机制尚未完全清楚,故对病因和发病机制仍需进一步研究,尤其对病因的研究可从源头上减少发病。HSP的触发因素虽然未知,但感染、疫苗接种、自身免疫、食物过敏原或其它因素等均可能是其触发因素;其发病机制目前认为是多因素的,系免疫异常、环境因素和个体遗传综合作用的结果。感染和食物因素被认为是儿童HSP主要的致病因素。非Ig E介导的食物过敏反应机制尚未完全清楚,Ig G,Ig A,Ig M,T淋巴细胞及其他的免疫活性细胞、细胞因子、补体等均可参与其发病,涉及II型、III型或IV型变态(过敏)反应。Ig A介导的III型变态(过敏)反应是HSP的免疫病理特征。牛奶、鸡蛋是儿童常见食物,其与HSP的相关性研究多是采用食物特异性Ig E/Ig G检测试剂盒检测的食物特异性Ig E/Ig G抗体。因HSP是一种Ig A血管炎,故研究食物特异性Ig A抗体在HSP中的作用有一定的意义。目前国内外缺乏食物特异性Ig A抗体在HSP中作用的研究报道,亦未见食物蛋白抗原成分在HSP血液及皮肤组织等的研究报道。本课题组希望通过此次研究,能够明确牛奶、鸡蛋等食物抗原及其特异性Ig A抗体与儿童HSP的相关性,为食物在HSP中的作用提供一定的理论依据。第一部分过敏性紫癜患儿血液中食物特异性Ig A抗体的水平及意义目的:通过检测HSP患儿和对照儿童外周血清牛酪蛋白(casein,CA)、牛β-乳球蛋白(bovineβ-lactoglobulin,BLG)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)及鸡蛋卵清蛋白(ovalbumin,VOA)四种食物蛋白特异性Ig A抗体的水平,并分析其临床意义,探讨上述食物蛋白特异性Ig A抗体在儿童HSP中的作用。方法:收集2016年4月至2017年9月期间在苏州大学附属儿童医院诊疗并符合本研究纳入标准的儿童的外周血清标本。研究对象:HSP患儿组160例,为急性期HSP患儿,其中有36例在恢复期配合来院复查并同意血液采集;正常对照组106例,为腹股沟斜疝、包皮过长及包茎的择期手术儿童;疾病对照组共140例,包括以下5组:38例非全身型幼年特发性关节炎(juvenile idiopathic arthritis,JIA)患儿,24例系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患儿,17例Ig A肾病(Ig A nephropathy,Ig AN)患儿,30例迁延性或慢性腹泻患儿(称为腹泻组),31例腹痛起病的胃炎、十二指肠球炎或/和消化性溃疡患儿(称为腹痛组)。同时收集HSP患儿临床资料、实验室检查资料、肾活检病人的病理资料及各对照组儿童的基本资料。首先构建检测食物蛋白特异性Ig A抗体的ELISA体系,并用以检测各组儿童上述食物蛋白特异性Ig A抗体的水平,结合HSP患儿临床及病理指标分析其临床意义。结果:1.成功建立了检测食物蛋白特异性Ig A抗体的ELISA体系。本研究每次试验拟合出的标准曲线方程的参数大小差别很小,且回归方程的R20.996,提示所建立ELISA体系的稳定性高及回归方程的拟合优度高;每次试验空白孔和新生儿阴性血清的OD值绝大多数小于0.1,均未超过0.2,说明试验的有效性和结果的可用性。2.正常对照组儿童外周血中存在基础水平的食物蛋白特异性Ig A抗体。四种食物蛋白特异性Ig A抗体水平在多组间比较,CA、BLG、VOA特异性Ig A抗体在各组间的比较,差异有统计学意义(P均0.001)。其中HSP患儿VOA特异性Ig A抗体水平高于正常对照组、腹泻组、腹痛组、JIA组及SLE组,差异均有统计学意义(P均0.01)。HSP患儿BLG特异性Ig A抗体水平高于正常对照组、腹泻组、腹痛组及JIA组,差异均有统计学意义(P均0.001)。HSP患儿CA特异性Ig A抗体水平比正常对照组的水平高,但低于Ig AN组的抗体水平,差异均有统计学意义(P均0.05)。本研究同时表明Ig AN组的CA特异性抗体水平除了与SLE组的水平差异无统计学意义外,高于其它各组的水平,差异均有统计学意义(P均0.05)。3.36例HSP患儿急性期和恢复期食物蛋白特异性Ig A抗体的配对检测结果显示,恢复期CA、BLG、BSA、VOA四种蛋白特异性Ig A抗体水平均较急性期相应抗体水平下降,差异均有统计学意义(P均0.001)。4.临床类型不同的患儿各组间比较,肾型HSP患儿的BLG特异性Ig A抗体水平低于关节型HSP患儿,差异有统计学意义(P0.05);混合型和肾型HSP患儿的VOA特异性Ig A抗体水平低于关节型HSP患儿,差异均有统计学意义(P均0.05)。5.食物蛋白特异性Ig A抗体与食物特异性Ig G抗体的相关性分析结果显示CA、BSA特异性Ig A抗体与牛奶Ig G抗体水平呈正相关(P均0.05)。VOA特异性Ig A抗体与蛋清/蛋黄Ig G抗体水平呈正相关(P0.05)。6.肾型HSP患儿中有17例行肾活检检查,BSA特异性Ig A抗体与肾小球Ig A沉积呈负相关(P0.05),与肾小球Fib沉积及病理分级之间无相关性。CA、BLG、VOA特异性Ig A抗体与肾小球Ig A沉积、肾小球Fib沉积及病理分级之间均无相关性(P均0.05)。7.HSP患儿血清总Ig A相关影响因素的多元回归分析结果表明,在可能影响其水平的23项因素中,能进入回归模型的因素按作用贡献大小依次为CA特异性Ig A抗体、VOA特异性Ig A抗体、BSA特异性Ig A抗体、年龄。回归模型中回归平方和为57.605,残差平方和为55.013,总计为112.618,可见回归平方和占总计平方和的一半以上,表明血清总Ig A一半以上的变异由该四项因素引起,其中BSA特异性Ig A抗体在回归模型中的作用是负的,其余三个作用是正的。8.受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线及曲线下面积(area under the curve,AUC)的分析结果提示,在区分HSP与正常对照组时,以CA特异性Ig A抗体最有价值,AUC为0.803,敏感性为0.763,特异性为0.707;其次是BLG特异性Ig A抗体,AUC为0.707,与CA特异性Ig A抗体相比,虽敏感性升高,但特异性下降。在区分HSP组与非风湿性疾病对照组(腹泻组、腹痛组)中的价值,以VOA特异性Ig A抗体最有价值,AUC为0.850,敏感性为0.763,特异性为0.787。其次是BLG特异性Ig A抗体,AUC为0.764,与VOA特异性Ig A抗体相比,虽敏感性升高,但特异性下降。在区分HSP组与其他风湿性疾病对照组(JIA、SLE)中的价值,以VOA特异性Ig A抗体最有价值,AUC为0.807,敏感性为0.775,特异性为0.726。其次是BLG特异性Ig A抗体,AUC为0.719,与VOA特异性Ig A抗体相比,敏感性升高,但特异性下降。在区分HSP组与所有对照组中的价值,以VOA特异性Ig A抗体最有价值,AUC为0.758,敏感性为0.763,特异性为0.630。其次是BLG特异性Ig A抗体,AUC为0.717,与VOA特异性Ig A抗体相比,敏感性升高,但特异性下降。结论:1.目前市场上没有食物特异性Ig A抗体检测ELISA试剂盒,本研究组成功构建了检测牛奶、鸡蛋蛋白成分特异性Ig A抗体的ELISA体系。检测结果提示牛奶、鸡蛋部分蛋白成分特异性Ig A抗体水平升高,病情缓解后均下降,提示其特异性Ig A抗体与儿童HSP的发病相关。其中以VOA特异性Ig A抗体的相关性最强,其次是BLG特异性Ig A抗体。2.在区分HSP组与疾病对照组及所有对照组中的价值,均以VOA特异性Ig A抗体最有价值,其次为BLG特异性Ig A抗体。BSA特异性Ig A抗体与肾型HSP患儿肾小球Ig A沉积负相关,提示BSA特异性Ig A抗体在肾型HSP中可能起一定的作用。第二部分过敏性紫癜患儿血液、皮肤及肾脏组织中食物蛋白成分的水平及意义目的:通过检测HSP患儿和对照儿童外周血清CA、BLG、BSA和VOA四种食物蛋白抗原的水平,及上述食物蛋白抗原在皮肤和肾脏组织中的沉积,进一步探讨上述食物蛋白抗原和其特异性Ig A抗体在儿童HSP中的作用。方法:采用购买的ELISA试剂盒检测各组儿童血清中食物蛋白的水平。该部分研究对象选取自第一部分,标本采集方法和保存同第一部分。急性期HSP患儿和正常对照组儿童从第一部分中随机选取,分别检测了97例和68例,36例HSP患儿急性期和恢复期的标本均进行检测。疾病对照组未纳入腹痛组,余同第一部分,即38例JIA,24例SLE,17例Ig AN,30例腹泻患儿。采用免疫组织酶标化学方法检测皮肤组织标本小血管上四种食物蛋白抗原的沉积。皮肤标本为2012年1月至2017年5月期间苏州大学附属儿童医院肾脏风湿科行皮肤活检的12例HSP患儿的皮肤蜡块标本,6例多指儿童被切除的手指皮肤蜡块作为正常皮肤对照组,同期肾脏风湿科行皮肤活检的其它病人的蜡块标本作为疾病对照组,包括4例变应性血管炎(allergic vasculitis,AV),3例幼年皮肌炎(juvenile dermatomyositis,JDM),1例多关节型JIA合并血管炎。采用免疫组织荧光化学方法检测肾脏组织标本肾小球上四种食物蛋白抗原的沉积。肾脏组织标本为2017年10月至2018年1月期间肾脏风湿科行肾活检的27例HSP患儿的标本,同期行肾活检的其它疾病的标本作为疾病对照组,包括5例Ig AN,5例肾小球性血尿,4例急性肾炎,5例SLE,1例NS。新鲜肾脏组织用恒温冷冻切片机制作切片,切片制作后即刻进行实验。结果:1.外周血清食物蛋白成分BSA和VOA在各组的绝大多数儿童中可以检出,BSA在各组检出率分别为:HSP:98.97%,正常对照组:91.18%,腹泻组:93.33%,JIA:94.74%,SLE:100%,Ig AN:94.18%。VOA在各组检出率分别为:HSP:98.97%,正常对照组:100%,腹泻组:100%,JIA组:97.37%,SLE组:100%,Ig AN组:100%。HSP患儿外周血清BSA和VOA水平与其特异性Ig A抗体均呈正相关性(P均0.05),且36例HSP患儿急性期和恢复期配对比较结果表明恢复期BSA和VOA的水平较急性期明显下降(P均0.05)。正常对照组、腹泻组、JIA组的BSA抗原与BSA特异性Ig A抗体呈正相关(P均0.05);SLE组、Ig AN组儿童的BSA抗原与其特异性Ig A抗体均无相关性(P均0.05)。各对照组儿童VOA抗原与其特异性Ig A抗体均无相关性(P均0.05)。2.外周血清食物蛋白成分CA、BLG在各组儿童中均有部分患儿因低于试剂盒最低检测限而未检出,CA在各组检出率分别为:HSP组:62.89%,正常对照组:35.29%,腹泻组:23.33%,JIA组:42.11%,SLE组:95.83%,Ig AN组:35.29%;BLG在各组检出率分别为:HSP组:54.64%,正常对照组:11.76%,腹泻组:46.67%,JIA组:55.26%,SLE组:91.67%,Ig AN组:41.18%。HSP组患儿CA、BLG的检出率均高于正常对照组儿童的检测率,低于SLE组患儿的检出率,差异均有统计学意义,且CA的检出率亦高于腹泻组及Ig AN患儿的检出率,差异亦有统计学意义(P均0.05)。HSP患儿外周血CA抗原与CA特异性Ig A抗体水平呈正相关(P0.05);配对比较结果表明恢复期BLG抗原水平较急性期下降,差异有统计学意义(P0.05)。各对照组儿童CA、BLG与其特异性Ig A抗体均无相关性(P均0.05)。3.皮肤组织食物蛋白抗原检测结果表明HSP患儿的皮肤小血管可检测到不同程度四种食物蛋白的沉积,CA和VOA的染色较深,BLG和BSA的染色相对较淡。HSP患儿CA、BLG和VOA的染色阳性血管平均密度之间的差异均无统计学意义(P均0.05),三者均大于BSA的染色阳性血管平均密度(P均0.05)。多组间比较显示,HSP患儿的CA、BLG、VOA的染色阳性血管平均密度高于正常儿童、AV及JDM组儿童(P均0.05);BSA的染色阳性血管平均密度高于正常儿童、JDM儿童(P均0.05),但与AV组相比,未显示有统计学差异(P0.05)。4.肾脏组织食物蛋白抗原检测结果表明HSP患儿肾小球BSA、VOA的沉积率分别为88.89%和81.48%,均高于急性肾炎组患儿的沉积率(P均0.05),BSA的沉积率亦高于肾小球性血尿组患儿(P0.05)。HSP患儿肾小球CA和BLG的沉积率分别为44.44%和74.07%,与其他对照组患儿的沉积率相比均无统计学差异(P均0.05)。结论:血液和组织学检查结果表明牛奶、鸡蛋部分蛋白成分与HSP的发病有较好的相关性。血液中牛奶、鸡蛋部分蛋白抗原与其特异性Ig A抗体水平相关,并与病情一致,推测食物蛋白抗原与其特异性Ig A抗体在小血管壁的沉积参与了HSP的发病。
【学位单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R725.5
【部分图文】：

13图 1.1 ELISA 检测食物蛋白特异性 IgA 抗体的标准曲线（X 轴：浓度，Y 轴：吸光度）2.3 急性期 HSP 与不同对照组儿童食物蛋白特异性 IgA 抗体的检测结果及比较急性期 HSP 患儿食物蛋白特异性 IgA 抗体与各对照组食物蛋白特异性 IgA 抗体比较，除 BSA 特异性 IgA 抗体在各组间的差异无统计学意义外，CA、BLG、VOA特异性 IgA 抗体在各组间的比较，差异均有统计学意义（见表 1.3）。HSP 组 VOA 特异性 IgA 抗体水平高于正常对照组、腹泻组、腹痛组、JIA 组、SLE 组等的水平，差异均有统计学意义，与 IgAN 组相比，差异无统计学意义；本研究同时表明腹泻组、腹痛组的 VOA 特异性 IgA 抗体水平低于正常对照组，差异有统计学意义。HSP 组BLG 特异性 IgA 抗体水平比正常对照组、腹泻组、腹痛组、JIA 组的水平高，差异有统计学意义，与 SLE 组、IgAN 组相比，差异无统计学意义。HSP 组患儿 CA 特异性

15图 1.2 各组儿童食物蛋白特异性 IgA 抗体的检测结果比较NCon：正常对照组；Dia：腹泻组；abp：腹痛组；HSP：过敏性紫癜组；JIA：幼年特发性关节炎组；SLE：系统性红斑狼疮组；IgAN：IgA 肾病组。2.4 急性期和恢复期均取得血液标本的 36 例 HSP 患儿食物蛋白特异性 IgA 抗体的配对检测结果及比较36 例 HSP 患儿急性期和恢复期食物蛋白特异性 IgA 抗体的配对检测结果显示，恢复期 CA、BLG、BSA、VOA 四种蛋白特异性 IgA 抗体水平均较急性期相应抗体水平下降，差异有统计学意义，见表 1.4，图 1.3。

图1.3 HSP患儿急性期和恢复期食物蛋白特异性IgA抗体的配对检测结果比较2.5 性别不同的急性期 HSP 患儿食物蛋白特异性 IgA 抗体的检测结果及男性 HSP 患儿四种食物蛋白特异性 IgA 抗体的水平和女性患儿相应食物性 IgA 抗体的水平相比，差异无统计学意义，见表 1.5。
【参考文献】

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本文编号：2882331