福州地区急性呼吸道感染儿童HCoV-NL63和HCoV-HKU1的检测与分析

发布时间：2020-11-18 23:48

　　 目的 分别建立人冠状病毒NL63(Human Coronavirus NL63)和人冠状病毒HKU1( Human Coronavirus HKU1)的实时荧光定量PCR(Real-time Fluorescent Quanti- tative PCR,FQ-PCR)方法检测并了解福州地区急性呼吸道感染(ARTI)患儿HCoV-NL63与HCoV-HKU1感染情况。 方法 分别设计HCoV-NL63多聚酶蛋白1a基因、HCoV-HKU1 pol基因的引物和Taqman探针。扩增1a基因片段、pol基因片段并将其克隆到PMD18-T载体上,构建质粒标准品,建立实时荧光定量PCR检测方法,建立标准曲线,进行敏感性、特异性试验,重复性试验。用建立好的荧光定量PCR检测收集到的151份临床ARTI患儿标本中两种病毒的感染情况,对结果进行比较分析。扩增HCoV-NL63核衣壳蛋白N基因与包膜蛋白E基因,对其序列进行初步分析。 结果 1、建立的FQ-PCR方法检测HCoV-NL63,线性范围为101 copies/μl～109copies /μl,批内变异系数为0.9%,批间变异系数为1.6%。用建立的HCoV-NL63实时荧光定量PCR方法检测2008-2009年度冬春季151例临床标本,共检出阳性2例,阳性率为1.3%(2/151)。普通PCR法检测结果与FQ-PCR检测结果一致。 2、福州地区HCoV-NL63的N基因核苷酸序列,氨基酸序列与GenBank中登录的原型株HCoV-NL63的N基因一致性均达97%以上,氨基酸序列与原型株有3个氨基酸的改变。HCoV-NL63的E基因核苷酸序列与GenBank中登录的原型株一致性达99%以上,氨基酸序列与原型株完全相同。 3、建立的FQ-PCR方法检测HCoV-HKU1,线性范围为102copies/μl～109copies /μl,批内变异系数为1.2%,批间变异系数为0.5%。用建立的HCoV-HKU1实时荧光定量PCR方法检测151例临床标本,未检出阳性标本。但用本法检测先前本实验室保存的2006-2007年度用普通RT-PCR检测出的一份HCoV-HKU1阳性标本,也显示阳性。 结论 1、本研究建立的HCoV-NL63、HCoV-HKU1 FQ-PCR检测方法灵敏度、重复性、特异性均较好,可用于临床呼吸道标本的检测以及流行病学监测。 2、福州地区HCoV-NL63的N基因、E基因均与原型株同源性高。 3、福州地区2008-2009年度冬春季急性呼吸道感染患儿中,存在比较低的HCoV-NL63感染率。150例ARTI患儿标本中未检测到HCoV-HKU1提示该病毒在本地区患儿中感染率更低。
【学位单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2010
【中图分类】：R725.6
【部分图文】：

经琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下表现为单一特异明亮条带，分子量约为526bp,见图1。M:wide DNA ladder ; A,B: 1a-1 基因片段扩增结果图 1 1a-1 基因片段扩增电泳图二、重组质粒测序结果用 HCoV-NL63 基因特异性的引物扩增重组质粒 pGEMT-Easy-1a-1，扩增产物进行测序，将测序结果与 GenBank 进行 BLAST 比较，结果证实所扩增的片段为1a-1 基因序列。部分测序图如图 2。

copies/μl浓度梯度，在ABI7300扩增仪上进行扩增，得到标准曲线Y=-2.867X+31.16（其中Y对应Ct值，X为标本拷贝数，图3）和相应的扩增曲线（图4）。相关系数（R2 ）为0.983，说明线性关系好。18

质粒倍比稀释浓度图 3 荧光定量 PCR 定量标准曲线图4 荧光定量PCR扩增曲线五、方法学评价结果对建立的HCoV-NL631a-1基因的FQ-PCR技术进行方法学评价1. 重复性试验1.1 批内重复性试验对同一模板同时进行 5 次重复测定，结果如图 5。19
【参考文献】

相关期刊论文 前4条

1 瞿小旺;漆正宇;段招军;刘劲松;刘巧突;刘文培;黄灿平;谢志萍;彭夫望;高寒春;郑丽舒;侯云德;;儿童急性呼吸道博卡病毒感染[J];病毒学报;2006年02期

2 段招军;黄灿平;瞿小旺;谢志萍;漆正宇;高寒春;彭夫望;刘文培;侯云德;;中国内陆发现HCoV-HKU1感染及N和S蛋白基因序列及进化分析[J];病毒学报;2006年04期

3 曾秀雅;伍严安;吴小青;陈发林;陈发文;赵采;马晓宁;;福州地区儿童急性呼吸道感染与人类冠状病毒NL63[J];福建医科大学学报;2008年01期

4 朱汝南;钱渊;赵林清;邓洁;王芳;廖斌;;从北京地区急性呼吸道感染患儿标本中检测到新型冠状病毒NL63基因[J];中华儿科杂志;2006年03期

相关硕士学位论文 前1条

1 吴小青;福州地区急性呼吸道感染患儿HCoV-HKU1、HCoV-OC43、RSV感染的检测及分析[D];福建医科大学;2008年

本文编号：2889383