乌鲁木齐县2-14岁人群HBV病毒株变异及OBI生物标志物研究

发布时间：2017-04-18 16:16

  本文关键词：乌鲁木齐县2-14岁人群HBV病毒株变异及OBI生物标志物研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:探讨中、小学生(7-14岁)及学龄前儿童(2-6岁)乙型肝炎病毒隐匿性感染(occult hepatitis B virus infection OBI)后S基因片段变异位点与OBI发生的关系;4种miRNA表达谱与OBI发生的关联性;初步探讨miRNA用于早期诊断OBI的可行性。方法:用整群抽样方法选择乌鲁木齐县4所中、小学综合性学校,对在校的学生采用酶联免疫试剂法(ELISA)和化学发光法进行乙肝HBsAg、抗-HBs两项血清学指标进行检测,对检测发现的HBsAg和抗-HBs 2项指标均为阴性的469名中、小学生的一份血清用QIAGEN公司的试剂盒提取HBV-DNA产物,利用聚合酶链反应(PCR)扩增HBV-DNA S基因片段,对43份有目的条带的PCR扩增产物进行HBV基因S区(544bp)序列测定。测序后建立HBV序列数据库,并用MEGA 5软件将测序结果与NCBI国际核苷酸序列数据库协作组(INSDC,原Genbank)收录的序列进行对比分析,以获得HBV基因S区序列的核苷酸变异规律;基于S区基因片段的进化模型选择,测定序列与INSDC收录的参考序列建立进化树,确定病毒的基因型,比较其基因型分布的差别,分析产生变异的核苷酸位点。40例序列测定成功的中、小学生按汉族,少数民族(包括汉族、哈族和回族)1:1匹配,符合匹配条件的有20名学生,这20名学生作为OBI研究对象。在整群抽样调查后,随机选取与OBI组年龄、性别和族别相匹配的20名健康学生和20名HBsAg阳性学生作为对照。共计60份血清用QIAGEN公司的试剂盒提取RNA,转录为cDNA,继而进行荧光定量PCR测定4种miRNA的相对表达量。用同样的方法选择4所幼儿园,对在园的学龄前儿童采用ELISA进行HBsAg、anti-HBs、HBeAg、anti-HBe和anti-HBc 5项检测,对259例HBsAg阴性血清用Promega公司的试剂盒提取HBV-DNA产物,进行PCR扩增HBV-DNA S基因片段,对发现的21份目的条带进行测序。用上述方法获得核苷酸变异规律,确定基因型。结果:469份中、小学生血样标本中用PCR扩增共发现43份HBV DNA阳性标本。其中,40份测序成功,32例B基因型样本均为adw2血清型,6例C基因型样本5例为adrq+血清型,1例为ayw2血清型。2例D基因型样本均为ayw2血清型。D基因型仅在哈萨克族学生中出现。S基因序列翻译成对应的氨基酸后分别发生I110L、S113T、K122R、T126I、F134Y、T143S、K159G和K160R突变。S基因MHR区氨基酸变异在性别、民族中的差异均无统计学意义。4种miRNA在健康对照者与HBV感染者和健康对照者与OBI感染者血清中的表达,let-7c,miR-122和miR-150的差异有统计学意义,但miR-23b在血清中的差异无统计学意义。另外,OBI感染者中,let-7c,miR-23b,miR-122和miR-150在汉族和少数民族血清中的差异没有统计学意义。OBI感染者的血清miRNA表达与S基因MHR区氨基酸变异次数的相关关系均为负相关。let-7c,miR-122,mi R-150和miR-23b与基因序列MHR区变异的突变次数的相关系数分别为-0.606,-0.902,-0.955和-0.897;P值分别为0.202,0.009,0.003和0.015.miR-122,miR-150,let-7c与S基因MHR区氨基酸变异次数显著相关。在血清中表达有差异的3种miRNA区分OBI感染者和正常对照时,曲线下面积(Area under curve,AUC)为96.4%(灵敏性:92.6%,特异性:90.8%)。用受试者工作特征(ROC)曲线评价各miRNA时,体现出了一定的诊断价值。259份学龄前儿童血样共发现21份HBV DNA阳性标本,均测序成功。其中1例由于存在氨基酸插入,没有检测出具体基因型。其余20例样本均为C基因型,其血清型均为adrq+亚型。S基因序列翻译成氨基酸后分别发生I110L、S123T、T124S、T126I、T131N、F134Y和P142H突变。126位点和134位点氨基酸的变异在中、小学生与学龄前儿童的差异均有统计学意义(P0.05)。结论:中、小学生及学龄前儿童隐匿性乙型肝炎病毒感染后S基因氨基酸存在不同频率的变异情况。miRNA的表达量与S基因MHR区氨基酸变异的突变次数呈现出一定的相关性。3种mi RNA的表达量与OBI有关,体现出了一定的诊断价值。
【关键词】：隐匿性乙型肝炎病毒感染 氨基酸变异 microRNA 中、小学学生 学龄前儿童
【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R725.1
【目录】：

• 摘要9-11
• ABSTRACT11-14
• 前言14-18
• 内容与方法18-28
• 1.研究对象18
• 1.1 抽样对象18
• 1.2 中、小学生中OBI研究对象18
• 1.3 miRNA研究对象18
• 1.4 学龄前儿童OBI的研究对象18
• 2. 相关仪器与试剂18-21
• 2.1 巢式PCR扩增体系20
• 2.2 反转录体系制备20
• 2.3 荧光定量PCR反应体系制备20
• 2.4 荧光定量PCR循环条件20-21
• 2.5 血清 miRNA 表达与基因序列变异位点的关联性研究变量赋值方法21
• 3.试验方法21-26
• 4.数据处理26
• 5.质量控制26-28
• 结果28-39
• 讨论39-45
• 小结45-46
• 致谢46-47
• 参考文献47-52
• 综述52-65
• 参考文献59-65
• 攻读硕士学位期间发表的学位论文65-66
• 导师评阅表66

【参考文献】

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本文编号：315271