一种防治柯萨奇病毒感染的新方法的研究

发布时间：2017-04-25 22:12

  本文关键词：一种防治柯萨奇病毒感染的新方法的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：柯萨奇病毒(Coxsackie Virus,CV)是一种人类病毒,其归属在小RNA病毒科(Picornaviridas)中的肠道病毒属(Enterovirus,EV)。本研究中用到的是柯萨奇病毒的一种很重要的亚型之一,柯萨奇病毒B组3型病毒(coxsackievirus B3,CVB3)。它在临床上能引起急慢性心肌炎和胰腺炎,发病率和病死率很高,特别是对于婴幼儿及新生儿来说是高易感疾病[1],新生儿及幼儿的病患较多,严重威胁着婴幼儿的健康及生存。虽然成人患病相对较少,但是一旦发病,同样非常严重,而且至今没有特效的药物或防治措施。因此,本研究针对CVB3感染的防治策略进行了探索,希望能探究出一条新的比较有效的防治途径。本研究首先用基因合成、拼接等分子生物学实验方法对天然Caspase-3进行了改造,设计出了含3C蛋白酶酶切位点的Caspase-3的基因,成功构建了3C蛋白酶.重组Caspase-3细胞凋亡通路,利用3C蛋白酶的酶切活性在细胞内激活Caspase-3信号凋亡通路,从而诱导感染细胞发生凋亡。该工作分别构建了真核表达载体,即质粒、腺病毒表达载体和慢病毒表达载体,递送入哺乳细胞内,检测了其表达产物及细胞毒性。之后分别在哺乳动物细胞及Balb/c乳鼠上进行防治CVB3感染效果的验证。结果显示,重组Caspase-3对细胞感染CVB3具有保护作用,并且对Balb/c乳鼠感染CVB3也具有保护作用。同时,为了这条途径最终能应用于人类病毒感染的防治,以求找出最佳的基因载体能起到更好的防治病毒的效果。我们对Caspase-3进一步地改造,成功构建了质粒pcDNA3.1(+)-recombination-signal peptide-caspase-3-6Aa(以下简称为p-rc-sig-6),又相继获得了含有改造Caspase-3的基因的腺病毒基因载体Ad-recombination-Caspase-3-6Aa( 以下简称为Ad-rc-6)和Ad-recombination-Caspase-3-8Aa(以下简称为Ad-rc-8)及慢病毒基因表达载体LV-recombination-signal peptide-Caspase-3-6Aa(以下简称为LV-rc-sig-6)。我们首先在哺乳动物细胞上进行了质粒、腺病毒基因载体及慢病毒基因载体的表达验证及抑制病毒感染的验证,继而又在乳鼠身上进行了腺病毒基因载体及慢病毒基因载体抑制病毒感染的验证,证实了这条通路是可行的,并且还具有广泛的实用性。我们在此做出了一些探索,希望能为以后这条通路应用于临床实验提供一些参考。这条通路的提出,为CVB3感染的防治及其治疗药物的研发提供了新的途径和思路,同时也为其它病毒的防治方法提供了借鉴意义,具有十分广阔的应用前景。
【关键词】：柯萨奇病毒 防治 3C蛋白酶 caspase-3 基因载体 凋亡信号通路
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R725.1
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 英文缩略词表10-11
• 前言11-21
• 1 病毒与宿主的相互作用11-12
• 2 柯萨奇病毒概述12-13
• 3 Caspase-3概述13-15
• 4 3C蛋白酶概述15-16
• 5 防治CVB_3感染的研究现状16
• 6 基因载体应用概述16-17
• 7 本课题的研究内容和意义17-21
• 第一章 质粒p-rc-sig-6、腺病毒Ad-rc-6和Ad-rc-8及慢病毒LV-rc-sig-6基因载体的构建21-35
• 1.1 材料、试剂及仪器21-24
• 1.1.1 引物、载体、质粒21-22
• 1.1.2 培养基22-23
• 1.1.3 主要试剂及耗材23
• 1.1.4 主要溶液23
• 1.1.5 仪器设备23-24
• 1.2 研究方法24-31
• 1.2.1 p-rc-sig-6表达载体的构建24-31
• 1.3 研究结果31-32
• 1.3.1 获得了重组质粒p-rc-sig-631-32
• 1.4 本章小结32
• 1.5 讨论32-35
• 第二章 上述3类基因载体的表达检测、对细胞活性的影响以及对细胞感染CVB_3的防治效果的研究35-57
• 2.1 材料、试剂及仪器35-37
• 2.1.1 表达载体、qPCR引物、菌株、细胞35-36
• 2.1.2 培养基和胰酶36
• 2.1.3 主要试剂及耗材36
• 2.1.4 主要溶液36-37
• 2.1.5 仪器设备37
• 2.2 研究方法37-43
• 2.2.1 Hela细胞培养37
• 2.2.2 冻存细胞株37-38
• 2.2.3 复苏细胞株38
• 2.2.4 细胞总RNA的提取及纯化38-39
• 2.2.5 反转录PCR(Reverse Transcription,RT-PCR)39-40
• 2.2.6 Real-time实时荧光定量PCR40-41
• 2.2.7 细胞转染41-42
• 2.2.8 CVB_3病毒的扩增及浓缩42
• 2.2.9 CVB_3病毒的滴度测定42-43
• 2.2.10 CVB_3病毒感染细胞43
• 2.3 研究结果43-53
• 2.3.1 质粒基因载体p-rc-6,p-rc-sig-6导入Hela细胞后的转录检测43-44
• 2.3.2 腺病毒基因载体Ad-rc-6和Ad-rc-8导入Hela细胞后的转录检测44-45
• 2.3.3 慢病毒载体LV-rc-sig-6导入Hela细胞后的转录检测45-46
• 2.3.4 转进腺病毒载体Ad-rc-6的Hela细胞的显微照片46-47
• 2.3.5 转进慢病毒载体LV-rc-sig-6的Hela细胞的显微照片47
• 2.3.6 质粒p-Cas-3,p-rc-6,p-rc-8的转染对Hela细胞活性无影响47-48
• 2.3.7 腺病毒载体Ad-rc-6和Ad-rc-8的导入对Hela细胞活性无影响48-49
• 2.3.8 慢病毒载体LV-rc-sig-6的导入对Hela细胞活性无影响49-50
• 2.3.9 计算得出了CVB_3病毒的滴度50-51
• 2.3.10 质粒p-rc-6和p-rc-8具有保护细胞群的作用51-52
• 2.3.11 腺病毒载体Ad-rc-6和Ad-rc-8具有保护细胞群的作用52-53
• 2.4 本章小结53
• 2.5 讨论53-57
• 第三章 腺病毒基因载体Ad-rc-6和Ad-rc-8及慢病毒LV-rc-sig-6对乳鼠感染CVB3的防治效果57-69
• 3.1 材料、试剂及仪器57-58
• 3.1.1 病毒,基因载体及实验动物57
• 3.1.2 实验耗材57-58
• 3.1.3 实验环境及设备58
• 3.2 研究方法58-59
• 3.2.1 腹腔注射腺病毒载体Ad-rc-6及Ad-rc-8及CVB_358
• 3.2.2 口腔灌胃腺病毒载体Ad-rc-6及Ad-rc-8及CVB_358
• 3.2.3 腹腔注射慢病毒载体LV-precas3-c6及CVB_358-59
• 3.3 研究结果59-65
• 3.3.1 建立了CVB3感染乳鼠的模型59-60
• 3.3.2 腺病毒载体Ad-rc-6及Ad-rc-8的转导能帮助乳鼠防御CVB_3感染60-63
• 3.3.3 慢病毒载体LV-precas3-c6的转导能帮助乳鼠防御CVB_3感染63-65
• 3.4 本章小结65
• 3.5 讨论65-69
• 结论69-71
• 附录71-73
• 参考文献73-79
• 攻读硕士期间发表的文章79-81
• 致谢81-82

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 关鹏;石振华;李亚青;王娜;;铁死亡:一种新的细胞死亡方式[J];生物化学与生物物理进展;2013年02期

2 贾林涛,于翠娟,许彦鸣,赵晶,高下,张淼丽,王成济,杨安钢;GFP共表达检测重组型Caspase-3对HeLa细胞凋亡的诱导作用[J];细胞与分子免疫学杂志;2001年03期

3 ;Avian influenza A virus H5N1 causes autophagy-mediated cell death through suppression of mTOR signaling[J];遗传学报;2011年11期

4 洪健;周雪平;;ICTV第八次报告的最新病毒分类系统[J];Virologica Sinica;2006年01期

5 董雅洁;高维娟;;bcl-2、bax、caspase-3在细胞凋亡中的作用及其关系[J];中国老年学杂志;2012年21期

  本文关键词：一种防治柯萨奇病毒感染的新方法的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：327186