紫癜性肾炎热毒伤络证全外显组变异位点的研究
发布时间：2021-07-31 12:17
目的:1.运用高通量测序技术探寻紫癜性肾炎热毒伤络证患儿全外显子组变异位点信息,筛选致病突变基因;2.回顾性文献研究,通过NCBI对候选基因进行查阅验证,确定儿童紫癜性肾炎热毒伤络证的可能致病基因,为中医临床精准治疗提供新的视野和理论依据。资料与方法:本次实验对象由6例HSPN热毒伤络证患儿及6例健康儿童组成,采取病例对照二阶段设计,第一阶段通过采集其外周静脉血提取DNA,对样本的全外显子区域DNA进行高效富集并进行高通量测序。对所得测序序列进行生物信息学分析,最终得到与疾病相关的候选致病突变。第二阶段通过查阅大量与候选基因相关的文献,并在NCBI中搜索研究候选基因,最终确定可能致病基因。结果:1.全外显组测序主要能够得到的信息是点突变,即单核苷酸多态性（SNP,singlenucleotide polymorphism）改变和插入缺失（INDEL,insertion-deletion）突变,对拷贝数变异（CNV,copy number variation）不敏感。2.12例样本中共有51141个SNP变异位点,其中经SIFT、Polyphen、Mutation Taster和CADD...
【文章来源】：辽宁中医药大学辽宁省
【文章页数】：48 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
电泳检测结果图
辽宁中医药大学2020届硕士学位论文-11-建库和捕获采用AgilentSureSelectHumanAllExonV6试剂盒，将外显组DNA随机打断成小片段，经修复和两端加接头制备DNA文库。接头文库与探针（经生物素标记后）进行液相杂交，再使用磁珠（带链霉素）将外显子捕获，经PCR扩增后进行文库质检，质检合格可测序(图3)。具体操作步骤如下：图3建库流程2.3.1DNA片段化Covaris破碎仪将外显组DNA随机打断成小片段，长度180bp-280bp左右。2.3.2末端修复反应片段化后的DNA存在5’或3’端突出，T4DNA聚合酶消化3’端突出，5’端被聚合酶补齐并加上磷酸基团，通过AgencourtAMpureXP磁珠纯化。2.3.33’端加“A”尾在3’末端加上单个腺苷酸“A”，可有效防止DNA平末端自连。2.3.4连接测序接头DNA文库两端利用T4DNA连接酶加上接头。2.3.5文库片段筛选
辽宁中医药大学2020届硕士学位论文-13-b.加入中性溶液、测序引物、四种荧光标记的dNTP及聚合酶，使dNTP合成到共价键结合的DNA链上，每次循环只能增加一个碱基，冲掉多余dNTP、酶等，在显微镜下进行激光扫描，根据荧光标记，通过互补原理推测模板碱基；c.每完成一个循环都要加试剂，切掉叠氮钠基团和荧光基团，暴露3’端羟基，同上操作，再次加入dNTP及酶，新的一个碱基延长完成，再次冲掉多余dNTP、酶，在显微镜下激光扫描，推测碱基……如此循环，直到得到足够所需碱基。5生物信息分析再得到原始序列后，参考GRCh37/hg19基因组分析序列（图4），大致包括三个部分：1)质量评估：从测序错误率、数据量和比对率三个方面进行评估，若不符合标准需重新建库或加测。2)变异检测：若符合标准，则对样本进行变异检测，包括SNP、InDel、CNV，并注释。3)变异位点的筛选及疾病相关性预测：对筛选出的变异位点，通过分析其变异致病性、富集分析与表型关联分析，筛选出HSPN外显组有害变异位点或基因。图4生物信息分析5.1数据质量控制5.1.1原始序列数据利用Illumina测序将原始数据转化为测序序列，即RawData。5.1.2测序数据质评a.原始数据筛选：精细过滤rawread，得到cleanreads。流程如下：删除接头序列；若不明碱基信息比例大于10%，去掉；若低质量碱基数达到一半，去除。
【参考文献】：
期刊论文
[1]张君从“络”论治过敏性紫癜[J]. 李爽,张君,张少卿. 中国中医基础医学杂志. 2019(04)
[2]刺络疗法联合西药治疗过敏性紫癜性肾炎热毒内炽证的临床研究[J]. 任德伟,邓文燕,杨敬. 针灸临床杂志. 2018(06)
[3]雷公藤多苷治疗过敏性紫癜性肾炎随机对照试验的系统评价[J]. 汪靓雯,邹新蓉,王长江,王小琴. 中国中药杂志. 2018(13)
[4]外显子组测序技术的原理及应用概述[J]. 李法君. 生物学教学. 2018(02)
[5]紫癜性肾炎的病因病机及治法探讨[J]. 刘洪,杨敬,黎颖,郑新,熊维建. 中国中医基础医学杂志. 2016(11)
[6]从温病学理论浅析小儿紫癜性肾炎的辨证论治[J]. 邓祥露,方琪玮. 中医儿科杂志. 2016(05)
[7]儿童过敏性紫癜中医体质临床研究[J]. 张少卿,张君,王绍洁,李铁男,陈家惠,赵历军,张蕊鹂,孔金凤. 中国中医基础医学杂志. 2015(07)
[8]IgA肾病患者AGT M235T基因多态性分析[J]. 黄海东,李新娟,王立瑞,蒋更如,朱淳. 实用临床医药杂志. 2011(24)
[9]外显子测序技术在疾病研究中的应用[J]. 辜清泉,杨琳,杨旭. 分子诊断与治疗杂志. 2011(05)
[10]肾小球病的络病分型辨治[J]. 刘玉宁. 新中医. 2011(05)
博士论文
[1]儿童紫癜性肾炎热毒伤络证lncRNA差异表达谱分析及潜在诊断标志物研究[D]. 庞爽.辽宁中医药大学 2019
[2]遗传性癫痫伴热性惊厥附加症新致病基因的捕获及验证[D]. 陈志红.南方医科大学 2015
[3]肝脏局灶性结节性增生的全外显子测序研究[D]. 汤洁莹.北京协和医学院 2015
[4]百岁老人听觉状况调查和耳聋家系致病基因检测研究[D]. 刘宸箐.中国人民解放军医学院 2015
[5]乳腺癌新辅助化疗前后基因变异检测及其功能论证[D]. 江一舟.复旦大学 2014
[6]石骨症发病的分子机制研究[D]. 欧明林.重庆医科大学 2014
[7]脊髓小脑性共济失调35型致病基因TGM6的细胞功能研究[D]. 关文娟.中南大学 2013
[8]先天性心脏病伴肢体畸形相关基因突变分析和拷贝数变异研究[D]. 罗成.中南大学 2012
[9]隐性遗传性耳聋外显子测序技术基因鉴定及基因型与表型关联研究[D]. 赵飞帆.中国人民解放军军医进修学院 2012
[10]全基因组外显子测序发现Marie Unna遗传性少毛症致病基因EPS8L3[D]. 张鑫.安徽医科大学 2012
硕士论文
[1]焦磷酸测序技术探寻儿童紫癜性肾炎基因多态性与中医证型的关系[D]. 孟德雪.辽宁中医药大学 2019
[2]胶原蛋白Ⅳ相关疾病的基因突变分析暨基因型和表型相关性研究[D]. 逯静茹.青岛大学 2018
[3]基于全外显子组测序技术筛选痛风相关基因的研究[D]. 李凯.昆明理工大学 2017
[4]全基因外显子测序技术探寻川崎病易感基因的研究[D]. 吴佳慧.苏州大学 2016
[5]早发型认知功能障碍四家系致病基因分析[D]. 商丹丹.郑州大学 2015
[6]新一代测序技术对宣威肺癌全基因组和全外显子组的研究[D]. 王潇.昆明医科大学 2015
[7]一个多巴反应性肌张力障碍家系基因突变筛查研究[D]. 柳明玉.华南理工大学 2015
[8]CaBP4基因突变在常染色体显性遗传夜发性额叶癫痫中的电生理功能研究[D]. 卓木清.南方医科大学 2015
[9]人类全基因组外显子芯片检测口腔癌单核苷酸多态性的初步研究[D]. 陆树健.广西医科大学 2014
[10]中国弹力纤维假黄瘤临床病理特征与ABCC6基因新致病性突变的研究[D]. 吴正胜.第四军医大学 2014
本文编号：3313451
【文章来源】：辽宁中医药大学辽宁省
【文章页数】：48 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
电泳检测结果图
辽宁中医药大学2020届硕士学位论文-11-建库和捕获采用AgilentSureSelectHumanAllExonV6试剂盒，将外显组DNA随机打断成小片段，经修复和两端加接头制备DNA文库。接头文库与探针（经生物素标记后）进行液相杂交，再使用磁珠（带链霉素）将外显子捕获，经PCR扩增后进行文库质检，质检合格可测序(图3)。具体操作步骤如下：图3建库流程2.3.1DNA片段化Covaris破碎仪将外显组DNA随机打断成小片段，长度180bp-280bp左右。2.3.2末端修复反应片段化后的DNA存在5’或3’端突出，T4DNA聚合酶消化3’端突出，5’端被聚合酶补齐并加上磷酸基团，通过AgencourtAMpureXP磁珠纯化。2.3.33’端加“A”尾在3’末端加上单个腺苷酸“A”，可有效防止DNA平末端自连。2.3.4连接测序接头DNA文库两端利用T4DNA连接酶加上接头。2.3.5文库片段筛选
辽宁中医药大学2020届硕士学位论文-13-b.加入中性溶液、测序引物、四种荧光标记的dNTP及聚合酶，使dNTP合成到共价键结合的DNA链上，每次循环只能增加一个碱基，冲掉多余dNTP、酶等，在显微镜下进行激光扫描，根据荧光标记，通过互补原理推测模板碱基；c.每完成一个循环都要加试剂，切掉叠氮钠基团和荧光基团，暴露3’端羟基，同上操作，再次加入dNTP及酶，新的一个碱基延长完成，再次冲掉多余dNTP、酶，在显微镜下激光扫描，推测碱基……如此循环，直到得到足够所需碱基。5生物信息分析再得到原始序列后，参考GRCh37/hg19基因组分析序列（图4），大致包括三个部分：1)质量评估：从测序错误率、数据量和比对率三个方面进行评估，若不符合标准需重新建库或加测。2)变异检测：若符合标准，则对样本进行变异检测，包括SNP、InDel、CNV，并注释。3)变异位点的筛选及疾病相关性预测：对筛选出的变异位点，通过分析其变异致病性、富集分析与表型关联分析，筛选出HSPN外显组有害变异位点或基因。图4生物信息分析5.1数据质量控制5.1.1原始序列数据利用Illumina测序将原始数据转化为测序序列，即RawData。5.1.2测序数据质评a.原始数据筛选：精细过滤rawread，得到cleanreads。流程如下：删除接头序列；若不明碱基信息比例大于10%，去掉；若低质量碱基数达到一半，去除。
【参考文献】：
期刊论文
[1]张君从“络”论治过敏性紫癜[J]. 李爽,张君,张少卿. 中国中医基础医学杂志. 2019(04)
[2]刺络疗法联合西药治疗过敏性紫癜性肾炎热毒内炽证的临床研究[J]. 任德伟,邓文燕,杨敬. 针灸临床杂志. 2018(06)
[3]雷公藤多苷治疗过敏性紫癜性肾炎随机对照试验的系统评价[J]. 汪靓雯,邹新蓉,王长江,王小琴. 中国中药杂志. 2018(13)
[4]外显子组测序技术的原理及应用概述[J]. 李法君. 生物学教学. 2018(02)
[5]紫癜性肾炎的病因病机及治法探讨[J]. 刘洪,杨敬,黎颖,郑新,熊维建. 中国中医基础医学杂志. 2016(11)
[6]从温病学理论浅析小儿紫癜性肾炎的辨证论治[J]. 邓祥露,方琪玮. 中医儿科杂志. 2016(05)
[7]儿童过敏性紫癜中医体质临床研究[J]. 张少卿,张君,王绍洁,李铁男,陈家惠,赵历军,张蕊鹂,孔金凤. 中国中医基础医学杂志. 2015(07)
[8]IgA肾病患者AGT M235T基因多态性分析[J]. 黄海东,李新娟,王立瑞,蒋更如,朱淳. 实用临床医药杂志. 2011(24)
[9]外显子测序技术在疾病研究中的应用[J]. 辜清泉,杨琳,杨旭. 分子诊断与治疗杂志. 2011(05)
[10]肾小球病的络病分型辨治[J]. 刘玉宁. 新中医. 2011(05)
博士论文
[1]儿童紫癜性肾炎热毒伤络证lncRNA差异表达谱分析及潜在诊断标志物研究[D]. 庞爽.辽宁中医药大学 2019
[2]遗传性癫痫伴热性惊厥附加症新致病基因的捕获及验证[D]. 陈志红.南方医科大学 2015
[3]肝脏局灶性结节性增生的全外显子测序研究[D]. 汤洁莹.北京协和医学院 2015
[4]百岁老人听觉状况调查和耳聋家系致病基因检测研究[D]. 刘宸箐.中国人民解放军医学院 2015
[5]乳腺癌新辅助化疗前后基因变异检测及其功能论证[D]. 江一舟.复旦大学 2014
[6]石骨症发病的分子机制研究[D]. 欧明林.重庆医科大学 2014
[7]脊髓小脑性共济失调35型致病基因TGM6的细胞功能研究[D]. 关文娟.中南大学 2013
[8]先天性心脏病伴肢体畸形相关基因突变分析和拷贝数变异研究[D]. 罗成.中南大学 2012
[9]隐性遗传性耳聋外显子测序技术基因鉴定及基因型与表型关联研究[D]. 赵飞帆.中国人民解放军军医进修学院 2012
[10]全基因组外显子测序发现Marie Unna遗传性少毛症致病基因EPS8L3[D]. 张鑫.安徽医科大学 2012
硕士论文
[1]焦磷酸测序技术探寻儿童紫癜性肾炎基因多态性与中医证型的关系[D]. 孟德雪.辽宁中医药大学 2019
[2]胶原蛋白Ⅳ相关疾病的基因突变分析暨基因型和表型相关性研究[D]. 逯静茹.青岛大学 2018
[3]基于全外显子组测序技术筛选痛风相关基因的研究[D]. 李凯.昆明理工大学 2017
[4]全基因外显子测序技术探寻川崎病易感基因的研究[D]. 吴佳慧.苏州大学 2016
[5]早发型认知功能障碍四家系致病基因分析[D]. 商丹丹.郑州大学 2015
[6]新一代测序技术对宣威肺癌全基因组和全外显子组的研究[D]. 王潇.昆明医科大学 2015
[7]一个多巴反应性肌张力障碍家系基因突变筛查研究[D]. 柳明玉.华南理工大学 2015
[8]CaBP4基因突变在常染色体显性遗传夜发性额叶癫痫中的电生理功能研究[D]. 卓木清.南方医科大学 2015
[9]人类全基因组外显子芯片检测口腔癌单核苷酸多态性的初步研究[D]. 陆树健.广西医科大学 2014
[10]中国弹力纤维假黄瘤临床病理特征与ABCC6基因新致病性突变的研究[D]. 吴正胜.第四军医大学 2014
本文编号：3313451
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