人巨细胞病毒感染细胞外泌体的microRNA深度测序及其在HCMV活动性感染患儿外周血检测结果与临床指标相关性的分析

发布时间：2021-11-14 08:32

　　目的:人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）是人类疱疹病毒组中最大的双链DNA病毒,感染较广泛,但是通常在健康群体中不发病,呈亚临床状态。然而,对于免疫低下或缺陷的群体,比如孕妇、儿童、移植受体或艾滋病患者,它会导致机体出现严重的并发症,甚至死亡。HCMV至今仍被认为是导致新生儿先天及围产期感染最重要的病毒之一,儿童尤其是6个月以下的婴儿和早产儿,由于其免疫力较低,极易罹患HCMV的感染,主要表现为不同程度的多器官组织的损伤尤其是对肝功能的损伤,此外神经系统、呼吸、血液及泌尿等系统都会出现不同程度的感染和损伤。HCMV感染机体后所诱导的免疫逃逸机制及致病机制十分复杂。而具有重要的基因调节作用的microRNA（miRNA）在HCMV感染过程中发挥了重要作用,在基因表达的转录后水平发挥作用,通过完全或不完全结合介导靶分子mRNA的降解或抑制其翻译,进一步调控基因的表达。细胞或病毒编码的miRNAs可以选择性地包装入外泌体等囊泡,广泛存在于人的多种体液,包括尿液、唾液、血液、乳汁、羊水、脑脊液等,并且不被相关核酸酶所降解,从而在机体局部或全身循环发挥细胞间信息... 

【文章来源】：中国医科大学辽宁省

【文章页数】：102 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

外泌体的鉴定A：透射电镜下观察到的经HCMV感染HELF细胞的外泌体；BC：Westernblot实验检测

中国医科大学博士学位论文12剂盒说明书中介绍该试剂盒采用的是膜吸附法分离纯化细胞外泌体，由于HCMV病毒具有脂质病毒包膜，且病毒颗粒大小与外泌体相近，为了避免由于外泌体样本中混有病毒颗粒，影响接下来外泌体核酸深度测序结果的真实性，我们对外泌体样本中是否混有HCMV病毒颗粒进行了检测鉴定。由于我们选择的HCMV的HanBAC株具有绿色荧光蛋白（greenfluorescenceprotein,GFP）标记蛋白，因此被感染HanBAC的细胞会在48小时后通过倒置荧光显微镜观察到绿色荧光，通常可作为常规检测感染效率的一种手段。我们将分离纯化的HanBAC株感染细胞外泌体加入正常HELF细胞培养液中，在48、72及96小时分别通过倒置荧光显微镜观察是否有GFP荧光信号，鉴定经试剂盒分离纯化的外泌体是否混有HCMV病毒颗粒。结果显示（见图1.2），与HanBAC感染细胞阳性对照比较，经外泌体处理的HELF细胞随着培养时间的延长，在绿色荧光激发条件下始终未见GFP荧光信号。由此提示，实验中分离纯化的HCMV感染细胞外泌体样本中没有HCMV病毒颗粒的污染。图3.2荧光显微镜观察GFP表达HELF细胞48h、72h和96h没有GFP的表达；HELF细胞和HanBAC感染后提取的外泌体共培养48h、72h和96h均没有GFP的表达；HELF细胞被HanBAC株感染后在48h有GFP的表达，并且在72h和96h逐渐增多。

中国医科大学博士学位论文14AB图1.3Agilent2100测序文库大小A和B两个文库长度均为140-150bp皆符合上机测序要求。3.4测序结果分析3.4.1小RNA文库的数据分析采用IIIumina公司的Hiseq2500测序技术对结果3.3中HanBAC感染/非感染HELF细胞外泌体小RNA文库进行测序，去除接头序列以及低质量序列，包括模糊碱基N，碱基质量小于10以及长度小于18nt的序列后，各获得干净序列的总read数分别为33,074,443和27,976,426，分别获得18-32nt长度特异性序列384,735种和


本文编号：3494306