环状RNA及rno c irc 0 004002/miR-342-5p/Wnt3a轴在肛门直肠畸形发生发展中的作用及机制

发布时间：2021-11-17 09:37

　　目的:肛门直肠畸形（anorectal malformations,ARM）是小儿外科中常见的消化道畸形,发生率约为1/5000¹/1500。目前大部分与ARM相关的疾病可以通过手术治疗,尽管手术效果较好,但术后长期的并发症往往需要患儿长期就医,影响了患儿的生长发育并给家庭造成了严重的负担。研究指出,ARM的病因具有复杂性以及多因素性,遗传因素中的基因突变及信号通路中各信号分子的相互作用和表达调控异常可能与ARM的发生相关。其中,Wnt信号通路在所有与ARM相关的信号通路及网络中占据着重要地位。已经证明Wnt/β-catenin经典信号通路在胚胎发育以及细胞增殖、分化、凋亡等生理过程中发挥着不可替代的作用,而上述生理调节功能也是参与肛门直肠正常分化的重要环节。然而,基因相关的上游分子表达及调控是否与ARM相关仍不十分清楚。环状RNA（circular RNAs,circRNA）是一类新近发现的内源性非编码RNA分子。与线性RNA结构不同,circRNA是闭合的环状分子,缺乏5’–3’极性或多聚核苷酸尾,因此,circRNA具有稳定性、特异性、丰富性和保守性,能够在... 

【文章来源】：中国医科大学辽宁省

【文章页数】：99 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分:ARM及正常大鼠胚胎肛门直肠组织中差异表达的circ RNA分子筛选、验证的相关研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 主要试剂和仪器
            2.1.1 主要试剂
            2.1.2 主要仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 肛门直肠畸形动物模型制备及组织标本收集
            2.2.2 ARM组及正常组大鼠胚胎肛门直肠组织相关的circ RNA高通量测序分析
            2.2.3 应用qRT-PCR对测序结果进行准确性验证
        2.3 统计学分析
    3 结果
        3.1 大体观察结果和组织标本收集分组
        3.2 ARM组及正常组胎鼠肛门直肠组织的高通量测序分析
            3.2.1 circ RNA的基本信息
            3.2.2 筛选差异表达的circ RNA
            3.2.3 差异circ RNA亲本基因的富集分析
            3.3 qRT-PCR验证差异表达的circ RNA的表达水平
            3.4 预测差异表达circ RNA的结合miRNA
        4 讨论
        5 结论
第二部分:Rno_circ_0004002在大鼠肠上皮细胞中的表达水平及相关功能研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 主要试剂和仪器
            2.1.1 细胞系
            2.1.2 主要试剂
            2.1.3 主要仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 Rno_circ_0004002的全长鉴定
            2.2.2 细胞复苏、传代及培养
            2.2.3 Rno_circ_0004002在IEC-6 细胞中的表达水平和定位
            2.2.4 Rno_circ_0004002siRNA序列和p LO5-ci R过表达质粒的设计和合成
            2.2.5 细胞转染分组
            2.2.6 细胞转染
            2.2.7 细胞增殖试验
            2.2.8 细胞凋亡检测
            2.2.9 细胞迁移实验
            2.2.10 Western blot实验测定EMT蛋白表达
            2.2.11 免疫荧光
        2.3 统计学分析
    3 结果
        3.1 Rno_circ_0004002的全长鉴定
        3.2 Rno_circ_0004002在肛门直肠组织及IEC-6 细胞中的表达水平
        3.3 Rno_circ_0004002siRNA序列和p LO5-ci R过表达质粒的转染效率
        3.4 Rno_circ_0004002对细胞增殖的影响
        3.5 Rno_circ_0004002对细胞凋亡的影响
        3.6 Rno_circ_0004002对细胞迁移能力的影响
    4 讨论
    5 结论
第三部分:Rno_circ_0004002/miR3425p/Wnt3a轴调控Wnt3a表达及细胞功能的机制研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 主要试剂和仪器
            2.1.1 细胞系
            2.1.2 主要试剂
            2.1.3 主要仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 双荧光素酶报告基因检测
            2.2.2 FISH检测rno_circ_0004002与miR3425p在IEC-6 细胞中共定位
            2.2.3 qRT-PCR和Western blot实验验证miR3425p及Wnt3a在ARM和正常胎鼠肛门直肠组织中的表达水平
            2.2.4 qRT-PCR和Western blot实验验证rno_circ_0004002/miR3425p/Wnt3a在IEC-6 细胞中的相互调控作用
            2.2.5 Rno_circ_0004002/miR3425p/Wnt3a轴对IEC-6 细胞功能的影响
        2.3 统计学分析
    3 结果
        3.1 Rno_circ_0004002是miR3425p的分子海绵,Wnt3a是miR3425p的直接下游靶基因
        3.2 miR3425p和Wnt3a在ARM及正常胎鼠肛门直肠组织中的表达水平
        3.3 FISH检测rno_circ_0004002与miR3425p在细胞中共定位
        3.4 Rno_circ_0004002调控Wnt3a m RNA及蛋白的表达
        3.5 Rno_circ_0004002靶向miR3425p调控Wnt3a的表达
        3.6 Rno_circ_0004002通过rno_circ_0004002/miR3425p/Wn3a轴调控IEC-6 细胞的增殖、凋亡和EMT功能
    4 讨论
    5 结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]环状RNA的分子特征、作用机制及生物学功能[J]. 周凤燕,杨青,朱熙春,蓝贤勇,陈宏.  农业生物技术学报. 2017(03)
[2]Circular RNAs in colorectal cancer: Possible roles in regulation of cancer cells[J]. María Isabel Taborda,Sebastián Ramírez,Giuliano Bernal.  World Journal of Gastrointestinal Oncology. 2017(02)
[3]几种类型的环状RNA:潜在的分子标记物[J]. 周丽,史济洲,张蒙.  生命科学. 2016(07)
[4]先天性肛门直肠畸形基因异常及其致病因素研究进展[J]. 张艳莉,任红霞.  中华胃肠外科杂志. 2016 (01)
[5]Wnt3a:functions and implications in cancer[J]. Sha He,Yi Lu,Xia Liu,Xin Huang,Evan T.Keller,Chao-Nan Qian,Jian Zhang.  Chinese Journal of Cancer. 2015(12)
[6]环状RNA与人类疾病[J]. 付丽云,胡耀仁,郭俊明.  中国生物化学与分子生物学报. 2015(08)
[7]竞争性内源RNA的生物学功能及其调控[J]. 李静秋,杨杰,周平,乐燕萍,龚朝辉.  遗传. 2015(08)
[8]微小RNA与卵巢癌研究进展[J]. 李明,姜桦.  国际妇产科学杂志. 2015(02)
[9]Sox10和EDNRB在人胚胎肠神经系统发育中的表达[J]. 李颖,黄英,王大佳,王维林.  中国医科大学学报. 2014(03)
[10]基因转录后调控在DNA损伤反应中的重要功能[J]. 林德玲,罗瑛,宋宜.  遗传. 2014(04)



本文编号：3500642