尘螨变应原Der f 6/pET32a(+)重组质粒构建、表达、纯化及其产物血清IgE结合率

发布时间：2024-03-29 22:20

　　目的:获得尘螨变应原第6组分Der f 6原核表达产物并检测其与尘螨过敏性哮喘患儿血清抗体IgE结合率。方法:酶切质粒p ET28a(+)-Der f 6获得目的基因Der f 6,将其与p ET32a(+)载体连接成质粒p ET32a(+)-Der f 6,转化BL21细菌后,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用Ni+离子亲和层析柱纯化表达产物,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹实验(Western blot)和蛋白质串联质谱(MALDI-TOF/TOF)鉴定纯化产物。以纯化获得的产物为包被抗原建立间接ELISA法检测尘螨过敏性哮喘患儿血清抗体反应情况。结果:成功构建了原核表达质粒p ET32a(+)-Der f 6,将该质粒转化E.coli BL21诱导表达,亲和层析纯化后,SDS-PAGE显示获得目的蛋白,Western blot验证其能够与载体的组氨酸标签结合,质谱鉴定其Der f 6结构一致。以此产物为包被抗原建立间接ELISA检测尘螨过敏性哮喘患儿血清,阳性率为41.3%(19/46)。结论:成功构建了原核表达质粒p ET32a(+)...

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【部分图文】：

图1质粒pET28a(+)-Derf6经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切电泳图

图2pET32a(+)-Derf6菌落PCＲ鉴定产物电泳图

狣erf6结构一致。2.3融合蛋白ELISA检测结果以纯化获得的pET32a(+)-Derf6原核表达产物为包被抗原进行ELISA检测，5健康体检合格儿童血清抗体的OD值为0.199，标准差为0.0159，以(0.199+3×0.019)=0.258为阈值，46份尘螨过敏性哮喘患....

图3SDS-PAGE和Westernblot验证纯化后pET32a(+)-Derf6原核表达产物

图3SDS-PAGE和Westernblot验证纯化后pET32a(+)-Derf6原核表达产物Fig．3SDS-PAGEanalysisandWesternblotanalysisofexpressedproductsofpET32a(+)-Derf6inE-.coliBL21....

图4纯化后的pET32a(+)-Derf6原核表达产物IgE反应性

图3SDS-PAGE和Westernblot验证纯化后pET32a(+)-Derf6原核表达产物Fig．3SDS-PAGEanalysisandWesternblotanalysisofexpressedproductsofpET32a(+)-Derf6inE-.coliBL21....

本文编号：3941389