利用外显子测序方法探究TBX5与室间隔缺损之间的关系

发布时间：2017-07-06 10:13

  本文关键词：利用外显子测序方法探究TBX5与室间隔缺损之间的关系

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【摘要】：研究背景和目的.室间隔缺损（ventricular septal defect，VSD）定义为左、右心室的间隔上存在交通。VSD是最常见的先天性心脏畸形，总发病率约占先心病的40％。室间隔缺损可单独发生，单纯VSD在足月活产新生儿中的发病率约为2‰，约占先心病的20％。它也可与其他复杂畸形同时存在（如法洛氏四联症、功能性单心室、完全型大动脉转位、纠正型大动脉转位及主动脉缩窄等），影响患儿的生存质量。由于对于正常心脏室间隔发育机制了解有限，VSD发病机理的知晓仍相当局限。目前研究认为室间隔是由两个组分形成：间质化细胞成分和肌细胞成分，前者主要由圆锥隔和房室通道处的心内膜垫融合而成，后者的组成机制仍存在争论。部分学者认为肌部室间隔的形成是左、右心室室腔增大过程中，其交界处游离壁的小梁组织融合而成；有学者则认为肌部室间隔起源于原始室间隔处的一堆细胞簇，细胞簇可向心内膜垫生长并形成肌部室间隔。不同的影响因素将造成不同部位的室间隔缺损。原始室间隔形成障碍将导致肌小梁部位的缺损；房室通道处心内膜垫间的融合障碍会造成流入道部位的缺损；动脉流出道部位的心内膜点发育异常可导致流出道部位的缺损甚至对位不良型室间隔缺损；心内膜垫与原发肌性室间隔间的融合障碍会导致膜部室间隔缺损。 TBX5基因从属于TBX家族，定位于人类12号染色体长臂2区4带1亚带，其cDNA全长244lbp,有9个外显子，编码518个氨基酸。其中3－7号外显子编码T－BOX蛋白（含180氨基酸），是DNA结合并发挥功能的区域（T－Boxdomain）。 TBX5蛋白产物结构在种属间（斑马鱼，爬行类动物，小鼠，鸡等）呈现高度的保守性，C端在转录活动过程中具有重要作用，基本都含有helix-span-helix二聚体区域和包括8个bp共有序列［(A/G)GGTGT (C/G/T)(A/G)］在内的DNA结合区域，此外还含有一个核定位信号，这有利于我们研究这一心脏发育过程中重要的转录因子。1997年，Basson等首次发现TBX5基因突变可造成心手综合征（Holt-Oramsyndrome,HOS; MIM142900）一类以心脏间隔缺损（房间隔、室间隔缺损）为主并合并不同程度的上肢和指关节畸形为特征的先天性畸形。当时研究认为TBX5的突变引起该基因表达量降低，即单倍剂量不足（haploinsufficiency），是导致HOS发生的主要原因。2003年Claudia等对2个ASD型HOS家系研究亦同样发现，其存在TBX5的突变；同年，Stella等对68个间隔缺损的患儿血样本进行测序发现9个TBX5突变（点突变和错义突变）存在于房间隔缺损和房室间隔缺损中，但在室间隔缺损中并无发现任何突变；而在2009年，刘等人的研究发现在中国汉族人群中TBX5的突变和单纯室间隔缺损有关，但具体致病机制并不明确。2012年Smemo等的研究提示TBX5基因非编码区域增强子的变化引起单纯室间隔缺损的表型，这提示了对TBX5在室间隔缺损发病机制中作用研究的新思路。目前，国内对VSD和TBX5基因突变相关性研究相对较少。对VSD潜在致病基因TBX5及其作用机理进行深入研究将有助于遗传咨询和产前诊断，进而进行产前干预，提高患儿的存活率和生存质量，并有可能在不久的将来将基因治疗引入到先心病的防治中。这对于减轻家庭和社会沉重的经济负担，提高人口素质具有重大的现实意义，符合《国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006-2020年）》提出的“将出生缺陷防治列为优先主题”的政策。 方法.病例组为216例VSD患儿，男125例，女91例。平均年龄128±321天,平均体重8.7±3.5公斤。所有入组患者均经二维超声心动图检查明确存在室间隔缺损，，缺损平均大小为7.65±3.73mm；伴随其他复杂先心病的患儿另行增强CT或心导管检测。另以250名健康儿童为对照，对照组儿童均经超声心动图检查证实心内结构正常，平均年龄4.93±1.14岁，其中男性135例，女性115例。病例组与对照组间男女性别无显著差异（P=0.57），病例组平均年龄（128±321天）小于对照组（4.93±1.14岁），差异有统计学意义（P0.001）。本研究符合医学伦理学标准并得到上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心医学伦理委员会的批准。经知情同意后采集外周静脉血2ml，置于柠檬酸钠抗凝管中，混匀后-80℃冰箱冻存备用。应用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增TBX5基因的全部外显子和外显子两侧部分内含子，并对扩增片段进行双向测序。应用BLAST程序将所测TBX5基因序列与GeneBank中的已知序列进行对比以检测基因突变。 结果.基因分析显示，在VSD组编码蛋白区域中未发现影响所翻译的蛋白质的氨基酸序列的突变。识别出一个新的TBX5基因多态：c.663+36TC，即为TBX-5第6外显子下游第36位胸腺嘧啶变为胞嘧啶成。等位基因T、C及其构成的3种基因型TT、TC、CC在VSD组和对照组间的频率分布差异有统计学意义（等位基因频率比较：Z=－2.126，P0.001；基因型频率比较：Z=－2.933，P=0.043）。结论.TBX5基因编码区域的突变可能不是引起膜周／对位不良型室间隔缺损的主要原因，TBX5在心胚发育期间可能参与室间沟（interventricular groove）处肌小梁的形成、融合和增生，并对肌部室间隔的发育有重要作用。此外单纯的散发VSD可能具有多元化的致病因素如基因间的共作用、非编码区域调控序列的变化、基因－环境间的作用等；此外TBX5蛋白定位于细胞核内的能力（nuclearlocalisation）降低极可能是除单倍剂量不足外造成单纯散发VSD的重要原因。从这些方面入手，结合最新的检测技术可能会更加全面地帮助我们认识VSD的致病机理。
【关键词】：先天性心脏病 室间隔缺损 TBX5基因 基因突变
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R725.4
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 符号和单位说明11-13
• 前言13
• 研究背景13-16
• 实验材料及方法16-22
• 实验结果22-25
• 讨论25-32
• 基于本研究的见解及今后实验的新方向32-34
• 参考文献34-40
• 致谢40-42
• 综述42-51
• 参考文献47-51
• 在校期间发表的论文、撰写的标书及获奖情况51

【共引文献】

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本文编号：525764