儿童Alport综合征的临床及遗传学特征研究

发布时间：2017-07-18 17:11

  本文关键词：儿童Alport综合征的临床及遗传学特征研究

  更多相关文章： Alport综合征 基因诊断 突变 基因型 临床表型

【摘要】：研究背景Alport综合征(Alport sydrome, AS)是一种常见的遗传性肾小球疾病,以持续性血尿、晶体及眼底改变、高频神经性耳聋及进行性肾功能衰竭为主要临床特征。AS有3种不同的遗传方式,85%为X连锁显性遗传(X-linked Inheritance AS, XLAS),由编码α5链的COL4A5基因突变所致,病变基因定位于Xq21-q22;15%是常染色体隐性遗传(Autosomal Recessive Inheritance, ARAS),其致病基因是COL4A3或COL4A4基因,病变基因定位于2q35-q37；罕见的有常染色体显性遗传(Autosomal dominant inheritance AS, ADAS),致病基因亦为COL4A3或COL4A4基因。过去认为AS为一种罕见病,早期调查发现AS的发病率为1：5000～10000我国大样本资料显示,全国儿科2315例行肾活检的患者中,AS占1.2%,随着诊断技术的进步以及对遗传病认识的提高和重视,临床上可见越来越多有关AS的报道。AS目前尚无特异性的根治方法,患儿多进展至终末期肾功能不全。在儿童终末期肾病(End-stage Renal Disease, ESRD)中,AS患儿约占3%。因其危害性极大,越来越引起临床医生的关注。但AS患儿发病隐匿、临床表现多样,相当一部分患儿临床表现不典型,临床医师极易漏诊或误诊,且AS预后较差,因此早期鉴别和诊断AS具有重要的临床意义。目前认为对于AS诊断较为可靠的标准为3条：电镜下肾小球基底膜(glomerular basement membrane, GBM)出现典型的超微结构改变；皮肤或肾组织基底膜Ⅳ型胶原α链表达异常；COL4A5/3/4基因突变。临床上30%的AS患者基底膜Ⅳ型胶原α链可无缺失表达,目前该现象并无确切的机制进行阐述,推测是因为某些突变对Ⅳ型胶原α链的结构和功能影响不大所致。AS患儿在疾病早期,电镜下肾小球基底膜可表现正常或仅表现为弥漫性变薄,并非所有AS均表现为GBM弥漫厚薄不均、分层甚至断裂等特征性病理改变。因此,对于基底膜Ⅳ型胶原α链表达正常或电镜下GBM未出现典型超微病变者,亦不能轻易排除AS。对于AS而言,临床表现以及肾组织(或皮肤)的Ⅳ型胶原α链染色及肾组织电镜检查仅为AS的诊断提供辅助资料,确诊该病最可靠的标准是基因诊断。AS相关致病基因有3个,分别为COL4A5基因(51个外显子)、COL4A3基因(52个外显子),COL4A4基因(48个外显子),因其外显子数目庞大且无热点突变,基因诊断并未广泛开展。传统的Sanger法测序认为是遗传病基因诊断的“金标准”,但其耗时、费力且价格昂贵,对于外显子数目庞大的AS致病基因并不适用。第二代高通量基因测序(Next generation squencing, NGS)较以往的测序技术而言,具有高通量、速度快、低成本的特点,利用NGS一方面能检测出遗传病已知的致病基因,另一方面还可发现未知致病基因突变或新的基因突变位点。国内采用该技木对AS家系进行研究的报道较少,多为病例报导或少数家系的基因突变分析。因此,本研究通过收集30例疑似及确诊AS的患儿,通过完善肾脏病理、临床表现及基因检测等资料,确立AS患儿的个体化诊断,进一步分析AS患儿的基因突变及临床表型特征,明确AS基因突变类型,丰富AS基因突变数据库,为AS深入的发病机制探讨提供基础工作。另外研究中检测到两例患儿存在同义突变,分别为c.3246GA (p.1082KK)、 c.465GA (p.155KK),更新了传统认为“同义突变不致病”的观念,为同义突变的功能验证研究提供了依据。目的本研究通过收集30例疑似及确诊AS的患儿,通过收集AS患儿家系的临床资料,初步分析AS临床表型的特点；通过完善肾脏病理、临床表现及基因检测等资料,确立AS患儿的个体化诊断,丰富AS的诊断深度；分析AS患儿的基因突变数据,明确AS基因突变类型,丰富AS基因突变数据库,为AS深入的发病机制探讨提供基础工作。方法选取2005年1月至2015年10月在南京总医院儿科病区住院确珍或疑似AS的30例患儿为研究对象。通过基因测序后所有患儿均符合AS诊断标准。收集患儿及家系中患者的性别、起病方式、眼耳病变情况、肾脏损伤表现等资料；收集肾组织病理资料,包括肾组织光镜、免疫荧光、电镜及肾组织基底膜Ⅳ型胶原检查结果,对AS患儿的临床表现进行初步分析。经征得本院伦理委员会批准,患儿家长同意并签署知情同意书后,收集30个AS家系成员的外周血标本,应用二代测序外显子序列捕获技术,对30个疑似和确诊AS患儿的全外显子组基因进行测序,分别设计针对突变位点的引物对其直系家属进行Sanger测序验证。通过dbSNP数据库、人类基因突变及相关基本疾病数据库(HMGD数据库)等公共数据库的过滤筛选突变基因,经SIFT软件对突变基因位点进行蛋白功能预测。对基因突变结果进行分析,确立AS患儿个性化的诊断体系。通过家系分析对AS双基因模式进行初步探讨。本研究统计分析均采用SPSS19.0软件进行。计量资料以均数±标准差(x±S)表示,两独立样本采用t检验,多组独立样本采用单因素方差分析；计数资料以率表示,采用Fisher确切概率法。以a=0.05作为检验水准,P0.05为差异有统计学意义。结果1 AS患儿临床表型的初步分析30例患儿均有不同程度的血尿(100%),镜下血尿者19例(63.33%),男性患儿15例,女性患儿4例；肉眼血尿者11例(36.67%),男性患儿5例,女性患儿6例。不同性别患儿间血尿程度无统计学差异(P=0.108)。镜下血尿者发病年龄为1月～10岁,平均发病年龄2.86±2.46岁；肉眼血尿者发病年龄为1岁～6岁,2.55±1.29岁。两者发病年龄无统计学差异(t=0.388,P=0.701)合并蛋白尿者23例(76.67%),男17例,女6例,无蛋白尿者7例(23.33%),男3例,女4例。根据24小时尿蛋白定量结果,将伴有不同程度蛋白尿的患儿分为四组,A组为阴性组,B组为少量蛋白尿组,C组为中等量蛋白尿组,D组为大量蛋白尿组。其中A组7例(23.33%),男3例,女4例；B组4例(13.33%),男3例,女1例；C组15例(50%),男12例,女3例；D组4例(13.33%),男2例,女2例。四组间男女患儿的构成比无统计学差异(P=0.322)。A组患儿平均发病年龄为2.71±1.11岁,B组患儿平均发病年龄4.05±2.85岁,C组患儿平均发病年龄为2.47±2.47岁,D组患儿平均发病年龄为2.50±0.58岁,四组间患儿的发病年龄无统计学差异(P=0.621)。30例患儿肾功能均处于CKD 1期,肾外表现少见,仅1例男性患儿(6.25%)9岁时检测出双侧对称性感音神经性,轻度听力下降23例患儿行肾穿刺活检,肾小球微小病变(MCD)13例(56.5%),系膜增生性肾小球肾炎(MsPNG)10例(43.5%),23例患儿均通过肾组织冰冻切片间接免疫荧光法检测肾组织Ⅳ型胶原α3、α5链表达,其中完全或部分表达缺失19例(82.6%),另4例患儿肾组织Ⅳ型胶原α3、α5链表达正常。9例患儿(39.1%)电镜结果见基膜致密层分层撕裂,呈“花篮样”改变,基膜厚薄不一等AS典型电镜改变,另2例表现为薄基底膜病,6例表现为系膜增生性改变,6例无肾小球。2 AS患儿的基因突变的测序和分析30例AS患儿,共检测出35个COL4A5/3/4基因突变位点,其中包括错义突变19个、同义突变2个、剪切位点突变4个、无义突变3个、插入突变2个、缺失突变4个、复杂突变1个。共发现COL4A5基因突变24个、COL4A3基因突变6个、COL4A4基因突变5个。通过Sanger测序对家系成员进行验证,结果发现20例突变来源于母亲,8例突变来源于父亲,8例为新生突变,1例先证者纯合基因突变分别来自父母双方,1例患儿突变来源不详。本研究共发现31例突变类型未见疾病报道。结合患儿临床表现、肾组织病理检查、家族史调查、基因突变分析,所有患儿均能明确诊断为AS。两例患儿(成员1、25)检测到COL4A5基因同义突变,分别为c.3246GA(p.1082KK)、c.465GA(p.155KK),经家系分析认为两个同义突变均具有致病性。XLAS患儿共26例,男性患儿16例,女性患儿10例。15例患儿的基因突变类型为错义突变(57.69%),2例为无义突变(7.69%),3例为剪切位点突变(13.04%),2例为插入突变(7.69%),2例为缺失突变(7.69%),2例为同义突变(7.69%)。不同突变类型家系患病成员进展至ESRD的年龄差异差异有统计学意义(P=0.018),错义突变进展至ESRD的速度较无义突变、剪切位点突变、框移突变缓慢。XLAS男性患者比女性患者更早进展至ESRD,两者发病年龄差异有统计学意义(P=0.043)。此外研究还发现5例患儿合并2个AS致病基因突变(成员1、5、9、12、25),但并不支持Mencarelli等[4]首次提出AS存在双基因遗传模式的论断成立；结论1 本研究中AS患儿发病年龄小,血尿为最常见的首发症状,均未进展至肾功能不全,肾外表现少见；AS早期肾组织病理光镜表现轻微且无特异性,主要以MCD为主；电镜表现常不典型,Ⅳ型胶原α链免疫荧光染色亦存在局限性,仅根据患儿的临床表型及肾组织病理结果,有可能漏诊或误诊；2基因检测完善了AS患儿的个体化诊断体系,有助于AS的早期诊断；明确AS基因突变类型,丰富AS基因突变数据库,为AS深入的发病机制探讨提供基础工作；3基因检测有利于判断AS患儿的预后情况,不同遗传型及不同基因突变类型的患儿预后均不一致；4通过家系分析,暂不支持AS存在双基因遗传模式。
【关键词】：Alport综合征 基因诊断 突变 基因型 临床表型
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R726.9
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-20
• 第一章 Alport综合征患儿临床资料的收集和初步分析20-35
• 1 研究对象20
• 2 研究方法20-21
• 2.1 主要试剂20
• 2.2 主要实验仪器20
• 2.3 统计学分析20-21
• 3 病例资料收集21
• 4 辅助检查21-23
• 4.1 尿液检查21
• 4.2 肾功能检查21-22
• 4.3 听力检查22
• 4.4 眼部检查22-23
• 4.5 肾脏组织病理检查23
• 5 结果23-30
• 5.1 一般情况23-24
• 5.2 肾脏表现24-26
• 5.3 肾外表现26
• 5.4 肾组织病理情况26-30
• 6 讨论30-34
• 7 结论34-35
• 第二章 Alport综合征患儿的基因突变的测序和分析35-63
• 1 主要实验试剂、仪器35-36
• 1.1 主要试剂35
• 1.2 主要仪器35-36
• 1.3 生物信息学途径和计算机分析软件36
• 2 实验方法36-40
• 2.1 标本收集和保存36
• 2.2 DNA提取36-37
• 2.3 全外显子组捕获与测序37-38
• 2.4 生物信息分析38-39
• 2.5 Sanger测序验证39-40
• 3 基因检测结果40-49
• 3.1 错义突变41-44
• 3.2 同义突变44
• 3.3 剪切位点突变44-45
• 3.4 无义突变45-46
• 3.5 插入突变46
• 3.6 缺失突变46-47
• 3.7 复杂突变47-49
• 4 AS的个体化诊断49-52
• 5 基因型和临床表型的关系研究52-55
• 5.1 AS不同基因突变类型的临床特点比较52-53
• 5.2 AS不同遗传方式的临床特点比较53-55
• 6 AS双基因模式探讨55-59
• 7 讨论59-62
• 8 结论62-63
• 参考文献63-69
• 附录69-70
• 攻读硕士学位期间成果70-71
• 致谢71-72

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1 Ferrara F.;Amato C.;张剑萍;;亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变导致卵巢过度刺激综合征1例[J];世界核心医学期刊文摘(妇产科学分册);2005年11期

2 Combi R;Dalprà L.;Ferini-Strambi L.;Tenchini M.L;袁海峰;;额叶癫痫与促肾上腺皮质激素释放激素基因突变的关系[J];世界核心医学期刊文摘(神经病学分册);2006年05期

3 智刚;苏成芝;;基因突变带来的启示[J];医学与哲学;1991年02期

4 潘宏铭;宋修山;;人群基因突变的检测[J];浙江医学情报;1995年02期

5 刘广志;新确定的基因与痴呆有联系[J];英国医学杂志(中文版);2000年03期

6 姚华,王国荃;砷与基因关系的研究进展[J];地方病通报;2001年01期

7 张苏明,刘小红,倪黎,金庆文,郭庆荣,宫道华;急性淋巴细胞性白血病与P~(53)基因突变的相关性研究[J];实用儿科临床杂志;2002年05期

8 庞庆丰,郭冬平,李晓,陈琪,范乐明;一个新的低密度脂蛋白受体基因突变位点[J];中华医学杂志;2003年05期

9 黄琰,李若葆;吸烟与肺癌基因突变的关系[J];潍坊医学院学报;2004年02期

10 易彦;张广森;;非肌性肌球蛋白重链9基因突变相关疾病[J];国外医学.输血及血液学分册;2005年04期

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1 吴竞生;徐修才;周荣富;方怡;王学锋;翟志敏;王鸿利;;β链基因突变引起一例遗传性无纤维蛋白原血症[A];中华医学会第八次全国血液学学术会议论文汇编[C];2004年

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3 肖生祥;刘艳;雷小兵;彭振辉;王俊民;周欣;耿松梅;李政宵;;先天性大疱性鱼鳞病样红皮病1家系的基因突变研究[A];中华医学会第十二次全国皮肤性病学术会议论文集[C];2006年

4 马绍刚;方佩华;吕枚;许静;李宁;陈慧;冯洁;;先天性甲状腺功能减退症基因突变研究[A];天津市核学会2005年学术交流会论文汇编[C];2005年

5 杨芳;金佩佩;王学锋;李薇;丁秋兰;王冠军;王鸿利;;2例新的基因突变导致遗传性蛋白S缺陷症[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年

6 王贵;裘卫东;;基因在疼痛与镇痛中的影响[A];浙江省医学会疼痛学分会成立大会暨首届浙江省医学会疼痛学分会学术年会论文汇编[C];2011年

7 孟岩;张续德;施惠平;赵时敏;姚凤霞;苏亮;黄尚志;;颅额鼻综合征的基因突变研究[A];第八次全国医学遗传学学术会议(中华医学会2009年医学遗传学年会)论文摘要汇编[C];2009年

8 曹林枝;;P53基因及其分子生物学作用[A];广西生物化学与分子生物学会第六次学术研讨会论文摘要[C];2003年

9 吴雪琼;张俊仙;李洪敏;梁建琴;钟敏;王巍;;结核分支杆菌耐药基因的研究[A];中国防痨协会全国学术会议大会学术报告[C];2001年

10 杨芳;金佩佩;王学锋;丁秋兰;王鸿利;李薇;王冠军;;2例新的基因突变导致遗传性蛋白S缺陷症[A];第11次中国实验血液学会议论文汇编[C];2007年

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1 报道员 周谷风;基因突变是好是坏[N];新华每日电讯;2010年

2 孙浩;基因检测：为防病摘除还健康的器官？[N];新华每日电讯;2006年

3 张民;英展开癌症相关基因突变测定研究[N];中国医药报;2007年

4 本报记者 李禾;吸烟导致的基因突变可代代相传？[N];科技日报;2010年

5 医学博士 科学松鼠会成员 致桦;基因检测是与非[N];中国经营报;2010年

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1 李娟;Fabry病GLA基因变异与临床表现的相关研究[D];石河子大学;2015年

2 杨浩;Peutz-Jeghers综合征的STK11基因突变研究[D];川北医学院;2015年

3 周双才;非小细胞肺癌EGFR基因突变状态与中医体质的相关性研究[D];福建中医药大学;2015年

4 王庆泊;胃肠道间质瘤c-kit基因检测临床意义的研究（附119例分析）[D];河北医科大学;2015年

5 钱晓燕;EGFR及KRAS基因突变临床检测方法学比较及其影响因素分析[D];北京协和医学院;2015年

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7 王薇;ARVC患者和正常人群桥粒基因突变及SNP比较研究[D];南京医科大学;2013年

8 郭秀;92例骨髓增殖性肿瘤JAK2V617F基因的检测及其临床意义[D];大连医科大学;2015年

9 蔡浩;青海晚期NSCLC患者EGFR基因突变状态与临床病理特征及疗效的关系[D];青海大学;2016年

10 陈兴旺;TTR基因突变c.-743A＞T对该基因表达的影响[D];遵义医学院;2016年

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