rhEPO对脑室周围白质软化新生大鼠神经保护作用

发布时间：2017-07-18 14:32

  本文关键词：rhEPO对脑室周围白质软化新生大鼠神经保护作用

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【摘要】：背景随着围产医学的进步,早产儿、低出生体重儿、多胎儿的救治成功率明显提高,然而,远期不同程度的神经发育问题却居高不降,尤其是早产儿脑室周围白质软化(Periventricular leukomalacia,PVL)造成的脑损伤,引起国内外学者广泛的关注。髓鞘磷脂蛋白(Myelin Basic Protein,MBP)是成熟少突胶质细胞的免疫组织标记物,是构成髓鞘的主要成分,检测MBP可以评价PVL患儿的神经信息传递的功能。促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)早期主要用于防治贫血,现大量研究表明,EPO对中枢神经系统损伤具有保护功能,然而对于其产生的机制以及使用的剂量尚无统一结论。重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)是一种通过基因重组DNA技术合成的具有与天然EPO完全相同氨基酸序列,生物学活性也相似的糖蛋白,在1989年通过美国食品药品管理局(FDA)批准而广泛应用于临床,在新生儿科的动物实验和临床研究中更显示了良好的疗效及应用前景。 目的通过对PVL模型大鼠进行不同剂量的rhEPO腹腔注射,检测EPO、EPOR、MBP在蛋白和基因水平的变化,探讨rhEPO对PVL的神经保护机制及应用的最佳剂量,进而为临床早产儿PVL的早期干预、治疗提供依据。 方法选择3日龄新生SD大鼠180只,随机分为假手术组、对照组、rhEPO小剂量治疗组(简写rhEPOS组)、rhEPO中剂量治疗组(简写rhEPOM组)、rhEPO大剂量治疗组(简写rhEPOH组),各组均36只。通过缺氧缺血制作类似早产儿脑室周围白质软化损害的动物模型。rhEPOS组、rhEPOM组、rhEPOH组在缺氧缺血后即刻分别给予rhEPO1000U/kg、rhEPO3000U/kg、rhEPO5000U/kg腹腔注射,24h/次,连续3次。对照组在缺氧缺血后于rhEPO组相同时间点给予注射等体积生理盐水处理；假手术组不予缺氧缺血处理也于相同时间点给予注射等体积生理盐水处理。在每次注射后12h(即造模后12h、36h、60h)以及生后10d,14d,28d处死动物,一部分脑组织进行石蜡包埋,另一部分脑组织置于液氮中保存。采用免疫组织化学技术及实时荧光定量PCR (Real-time Fluorescent Quantitative PCR, Real-Time PCR)技术,检测造模后12h、36h、60h及生后10dEPO、促红细胞生成素受体(erythropoietin receptor,EPOR)在蛋白和基因的表达变化；检测生后14d、28d时间点髓鞘磷脂蛋白MBP在蛋白水平和基因水平的表达变化,分析其在脑组织中的作用规律。SPSS17.0进行统计分析,P0.05有统计学意义。 结果 1.行为学改变：对照组大鼠缺氧缺血中出现全身发绀,反应差,频繁点头状抽搐,大小便失禁,部分动物于缺氧缺血过程中死亡。对照组缺氧缺血后,新生大鼠表现为进乳少,活动少,反应差等表现。假手术组表现为进乳好,活动有力,精神反应好。rhEPOS组与对照组相比,行为学差别不大;rhEPOM组出现进乳尚可,活动较少,反应稍差。rhEPOH组出现进乳可,活动可自如,反应可。 2.体重改变：在缺氧缺血后新生大鼠出现体重下降,体重增长缓慢情况,随着rhEPO用量的增大,动物的体重增长速度越接近正常生长速度。各组间使用单因素方差分析比较有统计学意义(P0.05)。 3.脑组织病理形态学改变：对照组在造模后出现脑白质区细胞排列紊乱,疏松坏死区域形成,胼胝体变薄,脑室扩大显著。假手术组脑白质细胞排列有序,层次分明,细胞核圆形、淡染,左右侧脑室对称。在rhEPOS组、rhEPOM组、rhEPOH组中随着rhEPO用量的加大,脑组织的形态学观察呈减轻趋势。 4.免疫组化结果及Real-Time PCR结果：EPOmRNA、EPO蛋白、EPORmRNA不(?)EPOR蛋白在假手术组脑组织内呈低量表达。对照组中EPOmRNA和EPO蛋白的表达均在造模后12h明显上升,36h显著下降,给予rhEPO后,EPOmRNA和EPO蛋白的下降速率放缓,rhEPO用量越大,下降速率越缓。EPORmRNA和EPOR蛋白在缺氧缺血后明显上升,12h达到顶峰,随着时间延长呈逐渐下降；rhEPO组与对照组相比,注射rhEPO对EPORmRNA、EPOR蛋白的表达变化无统计学意义。MBPmRNA和MBP蛋白在对照组脑组织14d,28d时间点呈低水平,低增长性表达状态,随着rhEPO注射量的加大,各时间点MBPmRNA和MBP蛋白表达量逐渐增大。MBPmRNA和MBP蛋白在假手术组脑组织14d、28d时间点呈高水平,高增长性表达。各组时间点比较具有统计学意义(P0.05)。 5.相关性分析：经Spearman秩相关性分析后,EPOmRNA与EPO蛋白两者的表达相关性分析显示二者呈正相关(r=0.881,P0.05)；EPORmRNA与EPOR蛋白两者的表达相关性分析显示二者呈正相关(r=0.854,P0.05)；MBPmRNA与MBP蛋白两者的表达相关性分析显示二者呈正相关(r=0.891,P0.05)。 结论 1.rhEPO对PVL具有神经保护作用,作用机制可能是通过调节EPO/EPOR系统起作用。 2.通过MBP的对比,研究证实rhEPO治疗PVL大鼠,使用5000U/kg的神经保护作用优于使用3000U/kg及1000U/kg。
【关键词】：脑室周围白质软化 大鼠 促红细胞生成素 促红细胞生成素受体 髓鞘磷脂蛋白
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R722.6
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-12
• 前言12-13
• 1 材料与方法13-24
• 1.1 研究对象13-14
• 1.2 主要仪器与试剂14-17
• 1.3 研究方法17-24
• 2 结果24-31
• 2.1 行为学及体重改变24-25
• 2.2 脑组织病理学改变25-26
• 2.3 免疫组织化学技术中EPO蛋白、EPOR蛋白、MBP蛋白的表达变化26-28
• 2.4 Real-Time PCR中EPOmRNA、EPORmRNA、MBPmRNA的表达变化28-31
• 2.5 相关性分析31
• 3 讨论31-38
• 3.1 模型的制备31-32
• 3.2 脑白质区EPO蛋白、EPOR蛋白和脑组织中EPOmRNA、EPORmRNA的变化分析32-36
• 3.3 脑白质区MBP蛋白和脑组织中MBPmRNA的变化分析36-38
• 4 结论38-39
• 附图39-52
• 参考文献52-57
• 综述：促红细胞生成素在脑室周围白质软化中的神经保护作用57-72
• 参考资料67-72
• 主要中英文缩写词一览表72-73
• 攻读学位期间发表文章情况73-74
• 致谢74-75
• 个人简历75

【参考文献】

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本文编号：558185