斑马鱼MeCP2的多克隆抗体制备及其对NOTCH信号通路的调控

发布时间：2017-07-31 00:23

  本文关键词：斑马鱼MeCP2的多克隆抗体制备及其对NOTCH信号通路的调控

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【摘要】：目的：构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1/zMe/eCP2(170-223),转化至大肠杆菌(Escherichiacoli, E.coli)感受态DH5a中诱导表达融合蛋白GST-zMeCP2(170-223)。经纯化的融合蛋白GST-zMeCP2(170-223)为抗原免疫新西兰大白兔(NZW Rabbit)获得兔抗斑马鱼抗体。甲基化-CpG结合蛋白2 (methyl-CpG-binding protein 2, MeCP2)基因突变引起进行性神经疾病-瑞士综合症,通过原位杂交技术和激光共聚焦显微技术,利用Notch转基因鱼(Tg(Tp 1 bglob:hmgb 1-mCherry))来研究MeCP2对斑马鱼神经发育的调控。方法：(1)斑马鱼MeCP2目的蛋白的表达和纯化及多克隆抗体的制备。选择斑马鱼MeCP2氨基酸(170-223)对应的基因序列为目的片段,以pEGFP-C1/MeCP2为模板扩增目的片段,将目的片段克隆到表达载体pGEX-4T-1中构建重组质粒,获得重组质粒pGEX-4T-1/zMeCP2(170-223)。重组质粒经PCR验证和测序鉴定正确后转化至DH5a中,经IPTG诱导表达。将诱导后的菌株用GST琼脂糖凝胶亲和层析纯化。SDS-PAGE分析纯化蛋白。用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗血清。(2)兔抗斑马鱼多克隆抗体的验证和功能检测：利用斑马鱼、大、小鼠脑组织通过Western-blot验证。利用免疫共沉淀技术,通过质谱,进一步验证MeCP2抗体的特异性及完成对MeCP2蛋白复合物的检测。运用免疫荧光技术对MeCP2进一步定位。(3)斑马鱼显微注射和胚胎原位杂交技术：斑马鱼胚胎发育在1-2细胞期注入6 nL的orpholino (MO)或mRNA,对特定基因的下调或过表达。胚胎收集与固定,4℃过夜,次日进行胚胎脱水,复水,洗涤,蛋白酶K处理,预杂交,杂交,封闭,洗涤,染色,胚胎信号采集。(4)免疫荧光技术：制备斑马鱼脑组织冷冻切片,封闭,一抗孵育过夜,荧光二抗避光孵育,含有DAPI的封片剂封片，荧光显微镜照相。结果：(1)以pEGFP-C1/MeCP2为模板经PCR扩增获得了162 bp的目的基因,通过双酶切和连接,成功构建了重组质粒pGEX-4T-1/zMe/eCP2(170-223),经PCR验证和测序鉴定目的基因质粒构建。含pGEX-4T-1/zMeCP2(170-223)的重组质粒经过IPTG诱导,纯化获得GST-zMeCP2(170-223)融合蛋白。经考马斯亮蓝染色,在32 kDa分子量处有特异性条带与预期的蛋白分子量相符。以纯化的融合蛋白为抗原免疫新西兰大白兔获得兔抗斑马鱼MeCP2 (zMeCP2)抗体。(2)考马斯亮蓝染色显示,zMeCP2抗体可以识别斑马鱼MeCP2蛋白,IP-westernblot结果显示,zMeCP2抗体能够富集并特异性识别大鼠MeCP2蛋白,成年斑马鱼脑组织免疫荧光显示，，MeCP2蛋白核定位。(3)质谱鉴定结果显示,多种蛋白分子与MeCP2存在相互作用,有两种经过Co-IP验证确定,分别是RNA Binding Motif Protein 4(RBM4)和PUR家族。其中PUR家族purA和purB之间能形成稳定的复合物,二者与MeCP2均能形成稳定的复合物。(4)原位杂交和免疫荧光实验显示,MeCP2在胚胎发育过程前期广泛表达,随后逐渐集中表达在脑部。在Notch转基因鱼(Tg(Tplbglob:hmgbl-mCherry))胚胎，Notch在敲低MeCP2的胚胎中的表达与野生型胚胎相比也明显降低,再共注射NICD-RNA后,Notch表达得到恢复。在敲低MeCP2的胚胎中,标志神经成熟的神经因子Ngn1、Pax2、 Pax3、Eno2、Map和RNA结合蛋白HUC表达下调。靶基因hey2,在敲低MeCP2的胚胎中的表达与野生型胚胎相比也明显降低。结论：(1)成功构建了pGEX-4T-1/zMeCP2(170-223)重组表达质粒,表达纯化得到了GST-zMeCP2(170-223)的融合蛋白。(2)表达纯化的zMeCP2(170-223)蛋白能够刺激兔子产生兔抗斑马鱼的MeCP2多克隆抗体。(3)得到的兔抗斑马鱼MeCP2的多克隆抗体能够特异性识别鼠源MeCP2并且可以用来做免疫共沉淀。(4)质谱鉴定出多种与MeCP2目互作用的蛋白,其中可以肯定的有PUR家族和RBM4。(5)PUR家族purA和purB之间能形成稳定的复合物,二者与MeCP2均能形成稳定的复合物。(6) MeCP2在胚胎神经发育前期广泛表达,敲低MeCP2能延缓胚胎神经细胞发育。(7) MeCP2能够通过Notch-hey2信号通路来调控斑马鱼神经细胞的分化。
【关键词】：斑马鱼 MeCP2 多克隆抗体制备 Notch信号通路
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.94;Q78
【目录】：

• 摘要7-9
• 主要缩略语英文索引9-10
• 前言10-15
• (1) MeCP2基因和蛋白的结构特点10-11
• (2) MeCP2的功能研究11-12
• (3) 斑马鱼神经发育模型12-13
• (4) Notch信号通路13-15
• 材料和方法15-29
• 1 材料15-20
• 1.1 斑马鱼品系15
• 1.2 表达质粒15
• 1.3 主要耗材15-20
• 1.3.1 主要仪器15-16
• 1.3.2 主要试剂16-17
• 1.3.3 主要试剂的配制17-20
• 2 方法20-29
• 2.1 抗体制备的技术路线20
• 2.2 抗原选择及引物设计20-21
• 2.3 重组质粒pGEX-4T-1/MeCP2(170-223)构建与验证21-22
• 2.3.1 目的基因的获得21
• 2.3.2 重组质粒pGEX-4T-1/zMeCP2(170-223)的构建21-22
• 2.3.3 重组质粒pGEX-4T-1/zMeCP2(170-223)的验证22
• 2.4 GST-zMeCP2(170-223)融合蛋白的表达和纯化22-23
• 2.4.1 GST-zMeCP2(170-223)融合蛋白表达条件的摸索22
• 2.4.2 GST-zMeCP2(170-223)融合蛋白的纯化22-23
• 2.5 兔抗斑马鱼zMeCP2(170-223)抗体的获得23
• 2.6 Western检测和免疫共沉淀23-24
• 2.6.1 Western检测23
• 2.6.2 免疫共沉淀23-24
• 2.7 斑马鱼脑组织冷冻切片的制备及免疫荧光24
• 2.8 斑马鱼的饲养24-25
• 2.9 斑马鱼的显微注射25-26
• 2.10 斑马鱼胚胎免疫荧光染色26
• 2.11 荧光成像拍摄26
• 2.12 斑马鱼胚胎原位杂交26-29
• 结果29-44
• 1 PCR扩增结果和重组质粒的构建及验证结果29-30
• 2 融合蛋白GST-zMeCP2(170-223)的表达条件摸索及纯化结果30-32
• 3 zMeCP2抗体的IP-western blot分析与免疫荧光32-34
• 4 部分质谱鉴定结果及相关IP-western blot验证结果34-35
• 5 MeCP2在斑马鱼神经发育过程中的表达35-36
• 6 注射MeCP2-MO斑马鱼表型变化36-37
• 7 注射MeCP2-MO后NOTCH信号的表达变化37-39
• 8 敲低MeCP2的胚胎对神经因子表达影响39-42
• 9 注射MeCP2-MO后转录抑制因子hey2的表达变化42-44
• 讨论44-47
• 全文结论47-49
• 参考文献49-53
• Abstract53-57
• 附录57-58
• 攻读学位期间发表的论文58-59
• 致谢59

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