CD40siRNA慢病毒载体的构建及其对EAM大鼠Treg细胞的影响

发布时间：2017-08-02 16:15

  本文关键词：CD40siRNA慢病毒载体的构建及其对EAM大鼠Treg细胞的影响

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【摘要】：研究背景、目的： 病毒性心肌炎(VMC)是儿科心血管系统常见疾病,严重危害儿童身体健康,其发病机制尚未完全阐明,亦无特效治疗。目前研究认为,主要是病毒感染及其诱导的免疫应答导致的心肌损伤,其中T淋巴细胞介导的细胞免疫起主导作用,研究病毒性心肌炎的免疫机制已成为当前国内外热点内容。实验性自身免疫性心肌炎(EAM)大鼠模型因其病情进展与人心肌炎极为相似,为研究心肌炎的免疫机制提供了最佳的动物模型。 T淋巴细胞介导的细胞免疫需双信号的活化,其中CD40与CD40配体(CD40L)是重要的共刺激信号通路之一。研究表明应用CD40-Ig阻断CD40/CD40L通路,能显著减轻病毒性心肌炎小鼠心肌炎症。能否应用RNA干扰技术从免疫反应的源头即通过沉默CD40的表达来减轻心肌炎症反应,国内外尚未见文献报道。本实验首先针对大鼠CD40基因构建了CD40siRNA慢病毒载体,然后应用 于EAM大鼠,探讨CD40siRNA对心肌免疫损伤的治疗作用及对CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)的影响。 研究方法： 1.针对大鼠CD40基因RNAi设计有效靶序列,合成靶序列的寡核苷酸序列。退火形成双链DNA,与经Hpal和Xhol双酶切后的GV118载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。随后进行Wester n-blot外源筛选最佳干扰靶点、慢病毒包装及病毒滴度测定。 2.40只雄性Lewis大鼠随机分成4组,即正常对照组、EAM模型组、CD40siRNA治疗组及siRNA对照组,每组10只大鼠。于实验第1天、第8天,正常对照组大鼠双后肢足垫区皮下注射PBS缓冲液0.2ml/只；另外三组大鼠双后足足垫区皮下注射充分混合的猪心肌球蛋白0.2ml/只。并且于实验第8天,CD4OsiRNA治疗组尾静脉注射25μl CD40siRNA慢病毒表达载体；siRNA对照组尾静脉注射25μl siRNA慢病毒表达载体。于实验第21天处死所有大鼠,光镜下观察心肌病理变化并计算病理积分；流式细胞仪检测大鼠脾脏中CD4+CD25+Treg的表达。 研究结果： 1. CD40siRNA成功插入慢病毒载体。慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒的滴度为2.0×109TU/mL。 2.各组大鼠均无死亡,正常对照组大鼠饮食、精神状态良好,其他3组于实验第4天渐出现精神不振、耸毛、进食少、懒动,部分大鼠双足垫出现溃疡、踝关节肿胀,以EAM模型组明显。 3.EAM模型组心肌病理组织可见炎症细胞浸润,伴有心肌细胞肥大变性,相邻细胞间隙增大,核大深染；CD40siRNA治疗组心肌组织病理积分明显低于EAM模型组(2.34±0.60vs3.40±0.35,p0.05)。 4. CD40siRNA治疗组大鼠脾脏CD4+CD25+Treg的表达较EAM模型组明显上调(40.70±4.00νs12.20±1.10,p0.05)。 研究结论： 1.成功构建大鼠CD40基因的RNAi慢病毒载体,为后期进一步研究病毒性心肌炎发病机制及新的治疗方法提供工作基础。 2. CD40siRNA可减轻EAM大鼠的心肌炎症,其机制可能与上调CD4+CD25+Treg的表达有关。
【关键词】：CD40siRNA 自身免疫性心肌炎 大鼠 调节性T细胞
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R725.4
【目录】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 符号说明11-12
• 前言12-13
• 第一部分 大鼠CD40基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定13-28
• 材料与方法13-23
• 结果23-24
• 讨论24-26
• 小结26-27
• 参考文献27-28
• 第二部分 CD40siRNA对自身免疫性心肌炎大鼠Treg细胞的影响28-37
• 材料与方法28-31
• 结果31-33
• 讨论33-35
• 小结35-36
• 参考文献36-37
• 附图37-44
• 综述44-50
• 参考文献48-50
• 致谢50-51
• 攻读硕士期间发表论文51
• 大会交流51-52
• 学位论文评阅及答辩情况表52

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

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本文编号：610127