孤独症相关基因NRXN3β启动子区域的研究

发布时间：2017-08-20 19:15

  本文关键词：孤独症相关基因NRXN3β启动子区域的研究

  更多相关文章： NRXN3β 启动子 顺式作用元件 转录因子

【摘要】：目的：确定NRXNSβ基因中具有启动子活性功能的区域,并限定最小的启动子区域范围,寻找具有调控NRXN3β基因启动子转录的顺式作用元件所在区域,证实顺式元件中对启动子活性起主要作用的核心碱基。方法：分别构建涵盖Genbank数据库里NRXN3β基因的转录起始位点上游约1500bp、下游约300bp的NRXN3β基因启动子正向序列和反向序列-荧光素酶报告基因载体。将人胚肾细胞HEK293用实验室常规方法培养后,使用自Invitrogen公司购得的转染试剂Lipofectamine2000,将构建的两个NRXN3β基因启动子-荧光素酶报告基因载体转染48孔板培养的HEK293并使其在该细胞内表达出荧光素酶。转染后的细胞进行裂解,细胞裂解液中的荧光素酶活性使用Promega公司购得的双荧光素酶检测试剂(E1910)进行测定,在同批次转染的内参pGL4.10载体的荧光素酶活性校准后,用最终活性的比值反应NRXN3β基因的启动子活性,确定NRXN3β基因序列NRXN3β-1445/+302E具有启动子活性。然后在该段序列基础上进行5’端删切和3’端删切并构建相应的启动子-荧光素酶报告载体比较荧光素酶活性的差异,发现了NRXN3β基因中具有启动子活性两个最小区域NRXN3β-543/-121E和NRXN3β-50/+117E,并确定对启动子活性起调控作用的顺式作用元件所存在的序列NRXN3β-110/-80o最后分别以p4NRXN3β-543/+117E, p4NRXN3β-100/+117E和p4NRXN3β-110/+117E为模版,使用基因定点突变技术在序列NRXN3P-110/-80中进行碱基突变并比较荧光素酶活性,确定了对启动子活性有重要作用的顺式作用元件中的核心碱基。结果：成功构建了涵盖不同区域序列的NRXN3β基因启动子-荧光素酶报告载体,最长插入序列片段长1747bp,包含NRXN3β基因的转录起始位点上游1445bp到下游302bp的序列。继续删切NRXN3β-1445/+302E的5’端及3’端并转染HEK293,发现序列中存在一系列影响启动子活性的激活区域及抑制区域,同时分析发现序列NRXN3β-543/-121E及NRXN3β-5O/+117E这两个序列中均可能含有启动子最小活性区域。在启动子NRXN3β-50/+117E的5’端删切发现-110/-80区域可能包含调控启动子转录的顺式作用元件,并对NRXN3β的启动子活性可能起关键作用。通过对序列-110/-90的碱基进行基因定点突变发现,位于-107/-105、-101/-99、-98/-95的碱基是顺式作用元件中的核心碱基。对比数据库发现-110/-80序列是一段高GC含量区域,存在多个候选转录因子的结合位点。结论：通过实验我们成功找到了包含NRXN3β基因启动子的两个最小区域NRXN3β-543/-121E和NRXN3β-50/+117E,并确定对启动子活性起主要作用的序列NRXN3β-110/-80,该序列中存在调控启动子活性的顺式作用元件,确定了顺式作用元件中的核心碱基所在位置。与顺式作用元件互相作用的转录因子有待确定,同时启动子具体结构和功能都需要更加深入的研究来证实。
【关键词】：NRXN3β 启动子 顺式作用元件 转录因子
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.94
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 1 材料和方法14-25
• 1.1 材料14-15
• 1.2 方法15-25
• 2 结果25-37
• 2.1 确定构建载体的NRXN3β基因序列具有启动子活性25-28
• 2.2 确定序列中启动子活性功能区的分布28-30
• 2.3 确定序列中具有启动子活性的两个最小区域30-32
• 2.4 证实对启动子活性起主要作用的核心碱基32-37
• 3 讨论37-39
• 参考文献39-42
• 全文总结42-43
• 文献综述43-50
• 参考文献48-50
• 致谢50-51
• 攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文题目51

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本文编号：708317