儿童血清25羟基维生素D水平及其受体基因多态性与哮喘的相关性研究

发布时间：2017-08-22 03:44

  本文关键词：儿童血清25羟基维生素D水平及其受体基因多态性与哮喘的相关性研究

  更多相关文章： 哮喘 25-(OH)D3 IL-4 IL-5 IFN-γ 基因多态性 VDR rs2228570 FokI rs7975232 ApaI rs1544410 BsmI rs731236 TaqI rs11574114 rs757343 Tru9I

【摘要】：一.研究背景 支气管哮喘是一种常见的呼吸道疾病,也是影响儿童健康最常见的慢性气道疾病之一,在全球范围内其发病率逐年上升,给患者家庭及社会带来了沉重的健康及经济负担,因此对支气管哮喘进行深入的研究具有深远的社会意义。支气管哮喘是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T细胞、气道上皮细胞等多种炎性细胞共同参与,它的重要特征是持续性气道炎症,慢性气道高反应性和可逆性气流阻塞。引起患儿反复发作的喘息、气促、胸闷或咳嗽等,并多在夜间和(或)清晨发作或加剧。严重者可出现哮喘持续状态危及生命,影响了患儿的身心健康。哮喘的发病机制复杂,与免疫和遗传学背景等密切相关。近年来,国内外研究发现,维生素D (VitD)在哮喘的病因学中可能发挥着重要的作用。 既往研究认为维生素D具有调节骨代谢和钙平衡的作用,而今越来越多的流行病学、遗传学和动物模型实验研究表明,其作为一种第二类固醇激素,还具有强大的免疫调节作用,与固有和适应性免疫应答均有密切关系。研究发现它可抑制各种Th1免疫反应介导的自身免疫性疾病的演进,如炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化(Multiple Sclerosis, MS)、I型糖尿病(Type1Diabetes Mellitus，，T1DM)等,并可能参与了哮喘的发病。相关研究表明减少阳光暴露与哮喘发病有关,而维生素D被认为是联系阳光暴露与哮喘发病之间的中介物。维生素D缺乏与不足在全世界均有较高的发病率,甚至发生在阳光暴露很充足地区的人群中,儿童是其高危群体,而25-(OH)-VD是人血清中含量最多且最稳定的VitD3代谢物,也是判断体内在皮肤合成的或经饮食摄入的VitD3含量的最佳指标。因此,在哮喘儿童中检测其维生素D水平具有重要的临床意义。 支气管哮喘属IgE介导的Ⅰ型慢性变态反应性疾病,CD4+T淋巴细胞被认为在支气管哮喘的发病过程中起重要的调控作用,根据其分泌的细胞因子不同,分为Th1、Th2两个亚群,目前认为Thl/Th2细胞失衡是哮喘发病的重要基础。越来越多的研究证实维生素D通过多种免疫细胞如肥大细胞、树突状细胞(DCS)、调节性T细胞(Tregs)等及其分泌的细胞因子的相互作用在哮喘的发病机制中发挥着重要的免疫调节作用。有资料表明,维生素D缺乏可能导致Tregs功能下降,Thl和Th2之间的平衡被打破。Camargo等研究证实1,25-(OH)-VD抑制Thl细胞的分化,实验证明它在体外对于初始T细胞极化过程中(Th分化的初期更明显)IL-4的产生有下调作用,对于Th2细胞分化及气道嗜酸性粒细胞也有着很好的抑制作用。Topilski等建立了鸡卵白蛋白(Ovalbumin, OVA)鼠哮喘模型,实验发现在哮喘诱发的最初阶段或Th2细胞分化完成阶段给予1,25-(OH)-VD显著地抑制了气道炎症反应和降低了支气管肺泡灌洗液中IL-4的水平。1,25-(OH)-VD可抑制效应性T细胞迁移,使其不能顺利到达其发挥效应的炎症部位。因而1,25-(OH)-VD对哮喘的影响机制可能包括下调IL-4和阻断效应T细胞迁移这两个方面。Pichler等发现在人类脐血单个核细胞中维生素D不仅抑制由IL-12介导的IFN-γ产生,同时也抑制了IL-4及由IL-4介导的IL-13的产生；但也有相反的证据,Aheu等对相当于人类预防佝偻病剂量的1,25-(OH)-VD与哮喘发病间的关系进行了动物实验研究发现维生素D可以促进抗原特异性T淋巴细胞的增殖,上调IL-4及IL-13等Th2型细胞因子的分泌,增加IgE的分泌。维生素D对Th2分化的作用及其具体机制如何,有待于更多的实验研究证实。 血清维生素D水平与日照时间、地理位置、饮食等因素有关,如紫外线强度及量适中促进维生素D吸收,海拔高的地方较海拔低的地方更易发生维生素D不足与缺乏等。除此以外,血清维生素D水平还与遗传因素密切相关。目前已发现了大量的与维生素D代谢及作用途径中相关的基因多态性,如细胞色素P4502R1(CYP2R1)基因、维生素D (VDR)基因、GC-球蛋白(GC)基因、细胞色素P45024A1(CYP24A1)基因等的突变可导致维生素D水平的异常。目前研究最多的是CYP2R1基因、VDR基因。 自1994年Morrison首次报道VDR基因多态性与骨密度的关系以来,对VDR基因多态性与糖尿病、结核、骨代谢、生长发育相关性的研究,一直是学者们关注的热点。VDR是维生素D生物活性形式1,25-(OH)-VD发生作用的主要受体,VDR基因于1988年被克隆出来,其定位于12q12-q14,长度为60-70kb,包括9个编码的外显子,共编码427个氨基酸,有多项研究显示VDR基因是观察哮喘基因非常好的候选者,其多态性与儿童和成人哮喘的发生具有相关性。VDR基因有5个常见的单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphisms, SNPs)分别是FokI(rs2228570)、BsmI (rs1544410)、Tru9I(rs757343)、ApaI(rs7975232)和TaqI (rs731236),分别位于第2外显子、第8内含子和第9外显子,及在3’端下游区域的poly-A多态性。rs2228570(FokI)位于第2外显子,在VDR基因的起始密码子上为T→C变异形成的。导致编码氨基酸密码子427ATG→ACG突变,使得翻译起始位点位于3个密码子以后,即翻译的蛋白质少3个氨基酸,为424个氨基酸,转录活性大大增强；rs7975232(ApaI)位于VDR基因第8个内含子,由于G→T突变,导致胸腺嘧啶突变为鸟嘌呤；rs1544410(BsmI)则由于G→A突变,其多态性虽不影响VDR的氨基酸序列,但蛋白质的合成受mRNA3'末端非翻译区的调控,rs1544410和rs7975232的多态位点正位于该区域,其碱基的改变影响了mRNA的稳定性,从而影响了VDR的表达；rs731236(TaqI)多态位点则是位于VDR的第9外显子,327ATT→ATC突变,其多态性是由无义突变引起,虽不会使VDR的氨基酸序列改变,但可能会导致mRNA的稳定性及转录效率的改变,也会影响到VDR的表达；rs757343(Tru9I)位点也位于VDR基因第8个内含子,其发生G→A突变,2000年由法国Ye等首先发现并报道,Zajickova等2003年再次证明了此位点的存在,多个研究表明BsmI、ApaI、TaqI、Tru9I这四个位点存在着连锁不平衡(Linkage disequilibrium, LD),尤其是BsmI和TaqI之间。BsmI还与位于3’非翻译区的poly(A)存在强烈连锁。目前研究显示VDR的SNP存在改变VDR蛋白的表达或在功能上的改变影响了维生素D活性,另外,由于VDR许多目的基因是通过一个经典的内分泌途径来调控维生素D的代谢,因此VDR蛋白分子或其功能上的任何改变都可能影响维生素D的代谢,从而促成哮喘的发生。 近年来,VDR基因多态性在佝偻病、癌症、糖尿病、骨质疏松等疾病已被广泛报告,与哮喘的关系也越来越引起大家的关注。Poon AH等的两项以北美家庭为研究对象的研究中发现VDR基因多态位点与哮喘的具有相关性,rs2228570(FokI)的存在导致第2外显子编码氨基酸密码子427ATG→ACG突变,影响了VDR转录活性；国内,Aaadi、Fang、Li等的三项针对VDR基因常见的多态位点与哮喘的关联研究中未有阳性发现；最近一项来自法国224个家庭的951个哮喘儿童的研究,虽然在VDR基因中发现了13种单核苷酸多态性(包括FokI、 BsmI、 TaqI),但是其与哮喘发生之间的联系却不具有统计学意义；而一项在突尼斯儿童对VDR基因的多态性研究中发现,rs2228570(FokI)、rs1544410(BsmI)、rs731236(TaqI)在哮喘组与正常对照组相比差异有统计学意义,增加了儿童发展为哮喘的危险性,而对于rs7975232(ApaI)未发现其与哮喘有相.关,该研究还发现BsmI-ApaI-TaqI存在强烈的连锁不平衡,可能影响mRNA的表达和稳定性,改变VDR基因翻译效率及VDR蛋白的表达,从而改变了哮喘患儿的表型。上述研究结果不一致,可能是因为基因的异质性和环境不同所造成。不同人群SNP的分布频率不同,同时哮喘是一种复杂的多基因遗传性疾病,许多基因错综复杂的相互作用及累积效应,使得遗传存在着差异,哮喘的易感性还与环境因素有关,如吸烟(被动或主动)、空气中粉尘、宠物、职业暴露等,这些均可影响实验最终的结果。目前国内外对于rs2228570(FokI)、rs7975232(Apal). rs1544410(BsmI)、rs731236(TaqI)、rs757343(Tru9I)基因突变与儿童支气管哮喘的相关性研究报道较少。 二.研究目的 本实验通过对哮喘患儿血清中血清25羟基维生素D水平和各T细胞亚群代表性细胞因子的检测,以及哮喘儿童维生素D受体基因多态性分析,拟探讨25-(OH)-VD.Thl/Th2在哮喘发病中的作用,分析哮喘的免疫学发病机制,为哮喘的免疫学治疗方法及其遗传易感性的筛选提供一定的理论和实验依据。 三.材料与方法 1、研究对象及分组 1.1哮喘组2012年3月-2013年6月于本院门诊随诊的40例哮喘患儿(临床缓解期),男22例,女18例,年龄6个月-3岁,平均(1.91±0.61)岁。其纳入标准均符合2008年中华医学会儿科学会呼吸学组制定的儿童支气管哮喘诊断标准：(1)反复发作喘息、咳嗽、气促、胸闷,多与接触变应原、冷空气、物理或化学性刺激、呼吸道感染以及运动等有关,常在夜间和(或)清晨发作或加剧。(2)发作时在双肺可闻及散在或弥漫性,以呼气相为主的哮鸣音,呼气相延长。(3)上述症状和体征经抗哮喘治疗有效或自行缓解。(4)除外其他疾病所引起的喘息、咳嗽、气促和胸闷。入组前一周均无使用激素及急性感染病史。 1.2对照组：2012年3月-2013年6月于本院健康体检儿童40例,男21例,女19例;年龄6个月-3岁,平均(1.85±0.59)岁。均无过敏性疾病病史,入组前一周均无使用激素及急性感染病史。 1.3所有研究对象均为汉族,在深圳生活的儿童。 1.4两组儿童组间性别、年龄差异、维生素D的使用情况均无统计学意义,家长均知情同意参加该项研究。 2、标本采集 两组儿童均于清晨空腹留取外周静脉血3ml,其中1ml,于室温(20～25℃)放置60min,2000r／min离心l0min,制备血清,-70℃冰箱冻存备检。另外2ml,提取全基因组DNA,-20℃冰箱冻存备检。 3、血清25-(OH)-VD、IL-4、IL-5.IFN-γ的测定 3.1采用酶联免疫吸附(ELISA)试验测定血清25-(OH)-VD、IL-4、IL-5.IFN-γ水平。所有的检测步骤均严格按说明书进行。 4、VDR多态位点rs2228570(FokI)、rs7975232(ApaI)、rs1544410(BsmI)、 rs731236(TaqI)、rs757343(Tru9I)的检测 4.1采用PCR扩增结合DNA直接测序法探测VDR基因有无多态位点rs2228570、 rs7975232. rs1544410、rs731236、rs757343存在 4.1.1采用苯酚/氯仿提取法提取全基因组DNA。 4.1.2设计涵盖VDR多态位点rs2228570、rs7975232、rs1544410、rs731236、rs757343的特异引物。 4.1.3扩增目的基因。 4.1.4基因测序及序列比对分析 3、数据分析 应用SPSS13.0软件进行统计学分析。计量资料用x±s表示,根据方差齐性结果,组间采用两独立样本t或t’检验；计数资料采用卡方检验。P0.05表示差异有统计学意义。 四.结果 1、血清25-(OH)-VD、IL-4、IL-5、IFN-γ的测定结果 1.1哮喘组与正常对照组比较,25-(OH)-VD水平均低于正常对照组,差异有统计学意义(t=7..498,P0.001)。 1.2哮喘组与正常对照组比较,IL-4水平均高于正常对照组,差异有统计学意义(t=14.03,P0.001)。 -1.3哮喘组与正常对照组比较,IL-5水平均高于正常对照组,差异有统计学意义(t=6.7,P0.001)。 1.4哮喘组与正常对照组比较,IFN-γ水平均低于正常对照组,差异有统计学意义(t=6.4,P0.001)。 2、VDR多态位点rs2228570、rs7975232、rs1544410、rs731236、rs757343的检测 2.1VDR基因序列rs2228570(FokI)基因型分为野生型TT,突变型TC、CC,在哮喘组和对照组内均检测到这三种基因型,但在两组内的分布无明显的差别(x2=0.854,P=0.652),等位基因T、C在两组中的分布差异无统计学意义(x2=0.948,P=0.330),其OR和95%可信区间CI分别为0.824(0.556-1.220)和1.130(0.882-1.448)。 2.2VDR基因序列rs7975232(ApaI)基因型分为野生型GG,突变型GT、TT,在哮喘组和对照组内未检测到突变型TT,基因型GG、GT在两组内的分布有明显的差异(x2=7.218, P=0.007), GG、 GT基因型0R和95%可信区间(CI)分别为1.923(1.158-3.193)和0.556(0.353-0.875)。 2.3VDR基因序列rs731236(TaqI)基因型分为野生型TT,突变型TC、CC,在哮喘组和对照组内未检测到突变型CC,基因型TT、TC在两组内的分布有明显的差异(x2=8.455,P=O.004),TT、TC基因型OR和95%可信区间(CI)分别为2.00(1.212-3.301)和0.519(0.323-0.833)。 2.4VDR基因序列rs11574114(本研究发现的多态位点)基因型分为野生型GG,突变型GC、CC,在哮喘组和对照组内均检测到这三种基因型,在两组内的分布有明显的差异(x2=7.632,P=0.022),等位基因G、C的0R和95%可信区间(CI)分别为0.661(0.510-0.875)和1.952(1.276-2.986)。 2.5VDR基因序列rs1544410(Bsm I)基因型分为野生型GG,突变型GA、AA,在哮喘组和对照组内未检测到突变型从,基因型GG、GA在两组内的分布有明显的差异(X2=7.366, P=0.007), GG, GA基因型OR和95%可信区间(CI)分别为0.586(0.390-0.881)和2.091(1.183-3.695)。 2.6VDR基因序列rs757343(Tru9I)基因型分为野生型GG,突变型GA、AA,在’哮喘组和对照组内均检测到这三种基因型,在两组内的分布有明显的差异(x2=6.651,P=0.036),等位基因G、A的OR和95%可信区间(CI)分别为0.684(0.525-0.891)和1.783(1.188-2.675)。 五.结论 本课题采用酶联免疫吸附实验、PCR扩增、基因测序等技术研究了血清25-(OH)-VD、IL-4、IL-5、IFN-γ在哮喘发病中的作用以及VDR基因多态性与儿童哮喘的相关性。通过研究我们得到以下结论： 1、哮喘患儿血清25-(OH)-VD浓度降低,提示我们哮喘患儿可能存在血清25-(OH)-VD不足或缺乏,血清25-(OH)-VD可能在哮喘发病中发挥作用。 2、VDR基因多态位点rs7975232、rs1544410、rs731236、rs11574114、 rs757343基因型及等位基因分布在两组间存在差异,其多态性可能与哮喘发病相关；VDR多态位点rs2228570基因型分布在两组间不存在差异,其多态性可能与哮喘不相关。 3、哮喘患儿血清中IL-4、IL-5表达升高,IFN-γ分泌下降,提示我们哮喘患儿可能存在T细胞亚群细胞因子失衡,即Thl细胞功能不足及Th2细胞功能亢进,Th1/Th2失衡可能在哮喘发病中发挥作用。
【关键词】：哮喘 25-(OH)D3 IL-4 IL-5 IFN-γ 基因多态性 VDR rs2228570 FokI rs7975232 ApaI rs1544410 BsmI rs731236 TaqI rs11574114 rs757343 Tru9I
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R725.6
【目录】：

• 摘要4-12
• ABSTRACT12-22
• 前言22-35
• 一、维生素D的生物学特性22-23
• 二、支气管哮喘与免疫调节23-24
• 三、维生素D与机体免疫24-26
• 四、维生素D与哮喘26-27
• 五、维生素D基因多态性在哮喘中的研究现状27-30
• 六、本研究的依据及内容30
• 参考文献30-35
• 实验技术路线35-36
• 材料与方法36-43
• 一、主要试剂36-37
• 二、主要溶液配制37-38
• 三、主要仪器38
• 四、实验方法步骤38-43
• 实验结果43-50
• 讨论50-59
• 一、维生素D的免疫调节作用50-52
• 二、血清维生素D水平与哮喘的关系52-54
• 三、维生素D基因与哮喘的相关性54-59
• 结论59-60
• 不足与展望60-61
• 参考文献61-66
• 英文缩略词表66-67
• 成果67-68
• 综述68-76
• 参考文献72-76
• 致谢76-77

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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本文编号：716884