HRE调控VEGF表达转染NSCs的实验研究

发布时间：2017-08-23 21:01

  本文关键词：HRE调控VEGF表达转染NSCs的实验研究

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【摘要】：目的：获得表达血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的基因工程神经干细胞(Neural stem cells, NSCs),研究缺氧反应元件(hypoxia-reponsive element, HRE)在缺氧条件下是否能提高VEGF基因的表达,以期为缺氧缺血性脑损伤寻求一种安全、高效的基因治疗方法。 方法：分离胎龄14天的SD大鼠胚胎前脑皮质,采用无血清培养的方法获得细胞克隆,应用间接免疫荧光法鉴定NSCs和分化的神经细胞。构建携带VEGF165基因的两种重组慢病毒载体pGC-FU-VEGF165,及9HRE-pGC-FU-VEGF165,将两者分别转染NSCs细胞,转染后的NSCs分为7组：A组为转染pGC-FU-VEGF165重组慢病毒后于常氧条件下培养的神经干细胞、B1组为转染9HRE-pGC-FU-VEGF165重组慢病毒后于常氧条件下培养的神经干细胞,B2组为转染9HRE-pGC-FU-VEGF165重组慢病毒后于缺氧条件下培养6h的神经干细胞,B3组为转染9HRE-pGC-FU-VEGF165重组慢病毒后于缺氧条件下培养12h的神经干细胞,B4组为转染9HRE-pGC-FU-VEGF165重组慢病毒后于缺氧条件下培养24h的神经干细胞,C组为转染空载体慢病毒于常氧条件下培养的神经干细胞,D组为未转染慢病毒于常氧条件下培养的神经干细胞作为的空白对照组,(常氧条件为95%02+5%C02；缺氧条件为2%02+98%N2)；荧光显微镜和流式细胞仪检测感染效率,采用RT-PCR法检测转基因NSCs的VEGF基因表达水平,Western-blot及Elisa检测转染后细胞分泌型血管内皮生长蛋白的表达水平,MTT法检测转染后NSCs的增殖活性。 结果： ①离体培养的胎鼠神经干细胞呈Nestin阳性； ②经测序两组目的基因与GenBbank中序列完全一致,成功构建HRE-pGC-FU-VEGF165重组慢病毒、pGC-FU-VEGF165慢病毒载体； ③将慢病毒转染至神经干细胞分组后在荧光显微镜下观察可见A组、B2组、B3组、B4组、C组基因工程神经干细胞发出绿色荧光,B1组、D组未见绿色荧光；经流式细胞仪检测A组细胞转染率50%左右,B2组、B3组、B4组、C组细胞转染率为80%左右,B1组、D组细胞转染率为0.49%左右； ④RT-PCR检测C组、D组、B1组细胞无明显VEGFmRNA表达,B2组、B3组、B4组、A组细胞均表达VEGFmRNA,B2组、B3组、B4组细胞、/EGFmRNA表达量显著高于A组(P0.05),且B组内细胞随着缺氧时间延长VEGFmRNA表达量增高(P0.05)； ⑤Western-blot检测C组、D组、B1组无明显VEGF蛋白表达,B2组、B3组、B4组、A组细胞均表达VEGF蛋白,B2组、B3组、B4组细胞VEGF蛋白表达量高于A组(P0.05),且B组内细胞随着缺氧时间延长VEGF蛋白表达量增高(P0.05)； ⑥Elisa检测C组、D组、B1组无明显分泌型VEGF蛋白表达,B2组、B3组、B4组、A组细胞可表达分泌型VEGF蛋白,B2组、B3组、B4组细胞分泌型VEGF蛋白表达量高于A组(P0.05),且B组内细胞随着缺氧时间延长分泌型、/EGF蛋白表达量增高(P0.05)； ⑦MTT检测示C组、D组细胞增殖活性无差异(P0.05),A组、B2组细胞增殖活性均高于与C组、D组(P0.05),B2组细胞增殖活性高于A组(P0.05)。 结论：成功构建具有缺氧诱导特性的高表达VEGF的基因工程NSCs,证明NSCs-VEGF基因工程干细胞可分泌活性VEGF蛋白,促进神经干细胞增殖,在缺氧时受HRE启动子作用,能提高VEGF基因的表达,随缺氧时间的改变HRE可对VEGF表达水平进行调控,为缺血缺氧性脑损伤实现安全、高效的基因治疗方法提供物质基础。
【关键词】：神经干细胞 血管内皮细胞生长因子 缺氧反应元件 转染
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R722.1
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 英文~.略词简表11-12
• 前言12-14
• 第一部分 神经干细胞的分离培养及鉴定14-21
• 1.1 材料14-16
• 1.1.1 实验动物14
• 1.1.2 主要仪器设备14
• 1.1.3 主要试剂14-15
• 1.1.4 主要试剂的配制15
• 1.1.5 实验器材的预处理15-16
• 1.2 方法16-18
• 1.2.1 胎鼠NSCs的原代培养16
• 1.2.2 NSCs的传代培养16-17
• 1.2.3 NSCs体外诱导分化17
• 1.2.4 间接免疫荧光法鉴定NSCs17-18
• 1.3 结果18-19
• 1.3.1 原代NSCs生长情况18
• 1.3.2 NSCs体外诱导分化18-19
• 1.3.3 间接免疫荧光法鉴定NSCs19
• 1.4 讨论19-20
• 1.4.1 神经干细胞分离培养的条件及生长情况19
• 1.4.2 神经细胞的鉴定19-20
• 1.5 小结20-21
• 第二部分 HRE调控VEGF表达转染NSCs的实验研究21-36
• 2.1 材料22-25
• 2.1.1 细胞22
• 2.1.2 主要仪器22
• 2.1.3 主要试剂及耗材22
• 2.1.4 主要试剂的配制22-25
• 2.2 方法25-31
• 2.2.1 pGC-FU-VEGF165重组慢病毒、HRE-pGC-FU-VEGF165重组慢病毒构建25
• 2.2.2 慢病毒感染目的细胞25-26
• 2.2.3 流式细胞仪检测转染效率26-27
• 2.2.4 PCR检测VEGFmRNA含量27-29
• 2.2.5 Western-Blot检测转基因大鼠神经干细胞体外VEGF165蛋白表达29-30
• 2.2.6 ELISA检测基因工程神经干细胞分泌型VEGF蛋白表达30
• 2.2.7 MTT检测基因工程神经干细胞增殖30-31
• 2.3 统计学方法31
• 2.4 结果31-33
• 2.4.1 pGC-FU-VEGF 165重组慢病毒、HRE-pGC-FU-VEGF 165重组慢病毒质粒鉴定31
• 2.4.2 荧光显微镜观察转染后的神经干细胞31
• 2.4.3 流式细胞仪检测转染率31
• 2.4.4 RT-PCR检测各组目的基因VEGF165在NSCs细胞中的表达31-32
• 2.4.5 Western blot检测VEGF165蛋白在NSCs细胞中的表达水平32
• 2.4.6 ELISA检测各组转基因神经干细胞分泌型VEGF蛋白表达32
• 2.4.7 MTT法检测基因修饰的NSCs增殖活性32-33
• 2.5 讨论33-34
• 2.5.1 目的基因的选择33
• 2.5.2 HRE启动子的选择及其对目的基因VEGF的调控作用33-34
• 2.6 小结34-36
• 结论36-37
• 参考文献37-41
• 附图41-51
• 综述51-59
• 参考文献56-59
• 致谢59

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 徐磊;张凯伦;谢艾妮;夏家红;;低氧反应元件对大鼠骨骼肌成肌细胞转染表达血管内皮生长因子基因的调控作用[J];临床心血管病杂志;2007年06期

2 屈素清;栾佐;刘卫鹏;席小辉;汪兆艳;;人神经干细胞移植治疗脑性瘫痪并重度视觉障碍患儿的疗效[J];实用儿科临床杂志;2009年10期

3 王东;张建军;马景擰;;神经干细胞NgR基因沉默立体定向移植治疗大鼠脑损伤[J];中国组织工程研究与临床康复;2010年14期

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本文编号：727256