mTOR通路调控早产鼠肺成纤维细胞在氧化细胞损伤和修复中的作用及机制

发布时间：2017-09-01 13:25

  本文关键词：mTOR通路调控早产鼠肺成纤维细胞在氧化细胞损伤和修复中的作用及机制

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【摘要】：目的研究不同浓度及时间氧暴露后早产鼠肺成纤维细胞增殖和凋亡情况;进一步探究雷帕霉素干预后不同浓度及时间氧暴露后早产鼠肺成纤维细胞增殖和凋亡情况;研究小RNA干扰后早产鼠肺成纤维细胞增殖和凋亡情况,同时分析其对mTOR通路上下游主要分子的基因和蛋白表达情况;进一步探究高体积分数氧、雷帕霉素及小RNA干扰对细胞外基质各胶原、凋亡相关基因和促纤维化因子的蛋白表达影响。方法实验对象为早产小鼠肺成纤维细胞即L929细胞。将新鲜完全培养基培养的细胞于21%,40%,60%,90%的氧浓度暴露3、7、14天后,倒置相差显微镜观察细胞形态、数目变化,Annexin V-FITC和PI双染色法检测细胞凋亡,MTT法评估细胞增殖;将含有10n M雷帕霉素的新鲜完全培养基培养的细胞于21%,40%,60%,90%的氧浓度暴露3、7、14天后,倒置相差显微镜观察细胞形态、数目变化,Annexin V-FITC和PI双染色法检测细胞凋亡,MTT法评估细胞增殖;通过小RNA干扰将细胞分为转染组和未转染对照组,应用MTT法评估两组细胞的增殖情况,Annexin V-FITC和PI双染色法检测两组细胞的凋亡情况,应用Western blot法检测mTOR通路上下游主要分子mTOR、4EBP1、P70S6K的蛋白表达情况,应用RT-PCR检测mTOR通路上下游主要分子mTORC1、4EBP1、P70S6K的基因水平,了解早产鼠肺成纤维细胞在氧化性细胞损伤和修复中的作用及mtor信号通路机制;将细胞分为90%氧浓度组、转染组、90%氧浓度+雷帕霉素组和对照组,应用elisa法检测细胞外基质Ⅰ、Ⅲ型胶原和纤维连接蛋白的水平,应用westernblot法检测凋亡相关基因bcl-2和p53的蛋白表达情况,应用westernblot法检测促纤维化因子ctgf和tgf-β的蛋白表达水平。结果1.高浓度氧干预的结果:a.高氧暴露后l929细胞增殖活性减弱,且随着氧浓度和氧暴露时间的延长l929细胞增殖活性减弱越明显,与空气对照组比较具统计学差异(p0.05);高氧暴露后抑制细胞增殖,抑制率随氧浓度和暴露时间延长而增加。b.高氧暴露后加速l929细胞凋亡坏死,随着氧浓度和氧暴露时间的延长l929细胞凋亡率增加,与空气对照组比较具统计学差异(p0.05)。c.高氧暴露后细胞胞体折光率降低,胞浆内颗粒物质增多,细胞生长不均匀,状态欠佳,细胞数量随氧浓度和氧暴露时间的延长而减少。2.雷帕霉素和高浓度氧共同干预后的结果:a.雷帕霉素和高浓度氧共同干预后l929细胞增殖活性明显减弱,且随着氧浓度、雷帕霉素和氧作用时间的延长l929细胞增殖活性减弱越明显,与空气+雷帕霉素组比较具显著性差异(p0.01);60%的高氧暴露后增殖抑制更明显;雷帕霉素和高浓度氧共同干预后可抑制细胞增殖,其抑制率随氧浓度、雷帕霉素和氧作用时间的延长而增加。b.雷帕霉素和高浓度氧共同干预后加速l929细胞凋亡坏死,随着氧浓度、雷帕霉素和氧作用时间的延长l929细胞凋亡率增加,与空气对照组比较具统计学差异(p0.05)。c.雷帕霉素和高浓度氧共同干预后细胞胞体折光率降低,胞浆内颗粒物质增多,细胞生长不均匀,状态欠佳,细胞数量随氧浓度、雷帕霉素和氧作用时间的延长而减少。3.mtorsirna干扰对l929细胞增殖、凋亡及mtor信号通路上下游分子的蛋白和mrna表达结果:a.mtorsirna干扰后转染组mtorc1、p70s6k和4ebp1的蛋白表达下降,与非转染组比较有显著性差异(p0.01)。b.mtorsirna干扰后转染组mtorc1、p70s6k和4ebp1的mrna表达下降,与非转染组比较有显著性差异(p0.01)。c.mtorsirna干扰后转染组l929细胞增殖活性减弱,与非转染组比较有显著性差异(p0.01);mtorsirna干扰后抑制l929细胞增殖,其抑制率为26.71%。d.mtorsirna干扰后可加速l929细胞凋亡,与与非转染组比较有显著性差异(p0.01)。4.高浓度氧、雷帕霉素及mtorsirna干预对l929细胞外基质影响的结果:a.与空气对照相比,90%高氧组、90%高氧+雷帕霉素组肺成纤维细胞的细胞外基质中col-Ⅰ、col-Ⅲ和fn均有升高,差异有统计学意义(p0.05);与空气对照组相比,转染组的col-Ⅰ、col-Ⅲ和fn均下降,差异有统计学意义(p0.05)。b.与空气对照相比,90%高氧组、90%高氧+雷帕霉素组、转染组肺成纤维细胞的bcl-2蛋白表达减少,p53蛋白表达增加,差异有显著性(p0.01)。c.与空气对照组相比,90%高氧组、90%高氧+雷帕霉素组的ctgf和tgf-β蛋白表达均升高,转染组的ctgf和tgf-β蛋白表达均下降,差异有显著性(p0.01);结论1.单纯高浓度氧作用于体外培养的早产鼠肺成纤维细胞时,可抑制其增殖,加速凋亡。2.雷帕霉素可抑制早产鼠肺成纤维细胞增殖,加速凋亡,其可能的机制是通过mTOR信号通路。3.mTORsiRNA可抑制早产鼠肺成纤维细胞增殖,加速凋亡。4.雷帕霉素、mTORsiRNA抑制早产鼠肺成纤维细胞增殖的可能机制是通过mTOR信号通路,特异性地抑制早产鼠肺成纤维细胞中mTORC1、4EBP1和P70S6K蛋白及mRNA的表达。5.90%浓度高氧、雷帕霉素均可促进高氧暴露后早产小鼠肺成纤维细胞的col-Ⅰ、col-Ⅲ和FN增多,阻断其增多的可能机制是通过mTOR信号通路的调节。6.Bcl-2是抗凋亡因子,可抑制肺成纤维细胞凋亡;P53是促凋亡因子,可促进肺成纤维细胞凋亡。90%浓度高氧、雷帕霉素、mTORsiRNA转染均可促进肺成纤维细胞凋亡。7.CTGF和TGF-β在氧化细胞损伤BPD肺纤维化时促纤维化作用的可能机制是通过mTOR信号通路,即mTOR信号通路通过促进CTGF和TGF-β的表达促进早产鼠肺成纤维细胞过度增殖参与BPD的修复过程。8.TGF-β和CTGF均为促纤维化因子,同时CTGF是TGF-β下游的生物学作用相对特异的促纤维化因子,可能是BPD肺纤维化的重要靶点。
【关键词】：肺成纤维细胞 mTOR信号通路 雷帕霉素 小RNA干扰技术 增殖和分化
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R722.6
【目录】：

• 摘要6-10
• Abstract10-16
• 英汉缩略语名词对照16-18
• 第1章 绪论18-22
• 第2章 不同浓度及时间氧暴露对早产鼠肺成纤维细胞增殖和凋亡坏死的影响22-34
• 2.1 材料22
• 2.2 方法22-26
• 2.3 结果26-31
• 2.4 讨论31-34
• 第3章 雷帕霉素对不同浓度及时间氧暴露对早产鼠肺成纤维细胞增殖和凋亡坏死的影响34-46
• 3.1 材料34
• 3.2 方法34-36
• 3.3 结果36-43
• 3.4 讨论43-46
• 第4章 mTORsiRNA干扰对不同浓度及时间氧暴露后早产鼠肺成纤维细胞增殖、坏死和mTOR信号通路的影响46-64
• 4.1 材料46-48
• 4.2 方法48-57
• 4.3 结果57-62
• 4.4 讨论62-64
• 第5章 高浓度氧、雷帕霉素和mTORsiRNA干扰对早产鼠肺成纤维细胞的细胞外基质的影响64-76
• 5.1 材料64-65
• 5.2 方法65-69
• 5.3 结果69-72
• 5.4 讨论72-76
• 第6章 结论76-78
• 参考文献78-84
• 文献综述84-93
• 参考文献90-93
• 攻读硕士专业学位期间的科研成果93
• 致谢93

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本文编号：772336