紫绀型先天性心脏病改变骨髓微环境代谢并诱导骨髓间充质干细胞变化的实验研究

发布时间：2017-09-04 11:42

  本文关键词：紫绀型先天性心脏病改变骨髓微环境代谢并诱导骨髓间充质干细胞变化的实验研究

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【摘要】：研究背景及目的先天性心脏病(先心病)是全世界首位出生缺陷疾病,紫绀型占先心病的10%。骨髓间充质干细胞(Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)是心血管疾病再生医学研究最常用的种子细胞。但BMSCs居住于相对低氧的骨髓微环境中,而紫绀先心病患儿长期慢性缺氧可能会进一步加重骨髓微环境的缺氧状态,从而改变骨髓微环境的代谢,影响BMSCs的细胞生物学行为。本研究旨在通过代谢组学技术研究紫绀先心病严重缺氧引起的骨髓微环境代谢改变及其对BMSCs细胞生物学行为的影响,并探讨引起BMSCs细胞生物学行为改变的机制和体外矫正方法。方法采用血气分析评估紫绀和非紫绀患儿骨髓微环境的氧浓度并检测缺氧诱导因子-1α (Hypoxia Inducible Factor-1α, HIF-1α)表达。在体外常规培养下比较紫绀和非紫绀组BMSCs的增殖、多向分化和抗凋亡能力的差异。通过气相色谱-飞行时间质谱联用(GC-TOF/MS)技术分析紫绀患儿骨髓微环境的代谢改变,发现D-半乳糖大量蓄积在紫绀组骨髓微环境中。体外培养添加D-半乳糖(D-Gal)模拟紫绀组骨髓微环境D-半乳糖蓄积以验证其对BMSCs生物学行为的影响。分析非紫绀、紫绀和D-Gal组BMSCs Notch1和细胞衰老相关通路蛋白的表达,并采用飞行时间质谱方法检测Notch1基因启动子区的甲基化程度。最后在体外培养阶段添加Notch受体激动剂Jagged-1多肽研究其能否逆转紫绀组BMSCs受损的增殖、分化和抗凋亡能力。结果紫绀患儿骨髓微环境氧浓度为3.3%显著低于非紫绀组6.5%的氧浓度(P0.01)而HIF-la呈高表达。紫绀组BMSCs的增殖、多向分化和抗凋亡能力较非紫绀组均显著下降。代谢组学结果提示紫绀患儿骨髓内糖酵解和糖异生途径加强,抑制三羧酸循环,并引起D-半乳糖大量蓄积。体外实验证明高剂量D-半乳糖可以阻断BMSCs细胞周期,抑制BMSCs的增殖、分化和抗凋亡能力,并上调β-半乳糖苷酶,表明D-半乳糖可以诱导BMSCs过早衰老。通过Western Blot分析发现紫绀和D-Gal组BMSCs Notch1、Id1、pRb表达受抑制,P16表达显著增加,而P53和P21无明显改变。通过飞行时间质谱甲基化分析发现P3、P4和P5代紫绀组和D-Gal组BMSCs Notchl基因启动子区GpG11.12.13、CpG24和CpG33三个位点甲基化程度显著增高,且不随细胞传代的代数而下降,提示D-半乳糖引起Notchl基因启动子区高甲基化。体外培养添加Jagged-1能上调Notch1、Id1和pRb,抑制P16表达,并能有效改善紫绀组BMSCs的增殖、分化和抗凋亡能力。结论紫绀型先心脏病引起骨髓微环境严重缺氧,导致骨髓微环境能量代谢方式改变和D-半乳糖蓄积。高浓度D-半乳糖引起Notchl基因启动子区高甲基化,进而抑制Notch通路活性,激活P16通路,引起BMSCs发生过早衰老,从而全面损害其增殖、分化和抗凋亡能力,且此效果具有记忆效应。Jagged-1通过激活Notch通路,可以有效逆转紫绀组BMSCs的衰老状态。
【关键词】：先天性心脏病 缺氧 骨髓间充质干细胞 D-半乳糖 过早衰老
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R725.4
【目录】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 引言8-10
• 本研究的技术路线10-11
• 材料和方法11-34
• 材料11-15
• 实验方法15-34
• 结果34-57
• 讨论57-61
• 参考文献61-68
• 文献综述68-78
• 参考文献73-78
• 附录 缩略词表78-80
• 致谢80-82
• 个人简历82-83

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 吴恩惠;李海生;赵彤;樊俊蝶;马鑫;熊雷;李伍举;朱玲玲;范明;;低氧对人骨髓间充质干细胞基因表达谱的影响[J];生理学报;2007年02期

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本文编号：791354