表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对人肝癌细胞的抑制作用

发布时间：2017-09-05 07:35

  本文关键词：表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对人肝癌细胞的抑制作用

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【摘要】：肝癌是世界上最常见的五大恶性肿瘤之一，肝癌的死亡率占癌症死亡率的第三位。手术治疗目前是治疗肝癌的有效方式，但对于癌转移病人的治疗效果有限。如果找到能够具有抑制肿瘤生长和转移双重功能的药物，对于癌症的早期治疗以及配合手术治疗的药物治疗将具有重要意义。已有研究表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate， EGCG)能抑制一些癌细胞的转移和诱导癌细胞凋亡，故本实验选用具有高转移性质的人肝癌细胞HCCLM6作为体外模型，研究EGCG的体外抗肿瘤作用。本实验的目的是从细胞凋亡、细胞转移、蛋白质组学方面探讨EGCG对肝癌细胞的抑制作用，并对其抑制作用机制进行了初步研究,为今后的动物实验和临床应用提供参考。 首先，本课题从诱导细胞凋亡的角度检测EGCG对人肝癌细胞HCCLM6和人正常肝细胞HL7702的抑制作用，并探讨EGCG诱导肝癌细胞凋亡的分子机制。MTT法检测EGCG对HCCLM6细胞和HL7702细胞增殖的抑制作用；流式细胞术检测EGCG对HCCLM6细胞和HL7702细胞凋亡率、细胞周期和线粒体膜电位的影响;Western-bloting检测EGCG对HCCLM6细胞和HL7702细胞Bcl-2，NF-kB，Bax, P53,caspase-9，caspase-3和cytochrome-c蛋白表达的影响。结果显示EGCG(10-100μg/ml)能显著抑制HCCLM6细胞的增殖作用并呈一定的剂量依赖性；EGCG从80μg/ml开始对HL7702细胞有显著抑制作用。EGCG（10，30μg/ml）可以诱导肝癌细胞HCCLM6凋亡，降低其线粒体膜电位，阻滞细胞周期于G0/G1期；EGCG（10，30μg/ml）不能诱导人正常肝细胞HL-7702的凋亡，对其线粒体膜电位和细胞周期也没有明显影响。该浓度下EGCG处理HCCLM6细胞后，Bcl-2和NF-kB蛋白表达显著下降,Bax,P53,caspase-3和caspase-9蛋白的表达显著升高，cytochrome-c由线粒体向细胞质释放；但EGCG作用前后HL-7702细胞后这些蛋白的表达均无明显影响。这些结果表明EGCG可以选择性作用于肝癌细胞，同时不影响正常肝细胞的功能。EGCG主要通过线粒体途径引起HCCLM6细胞凋亡。所以在诱导肿瘤细胞凋亡方面，，EGCG可以作为一个潜在的治疗肝癌的药物。 其次，本研究旨在检测EGCG对HCCLM6细胞转移的抑制作用，并探讨EGCG抑制HCCLM6细胞转移的作用机制。用体外迁移和侵袭实验模拟HCCLM6细胞的体内转移行为，检测EGCG对细胞转移的影响;用明胶酶谱法和RT-PCR法探讨EGCG抑制HCCLM6细胞转移的机制。迁移和侵袭实验结果显示EGCG(5，10μg/ml）能显著抑制HCCLM6细胞的侵袭和迁移；明胶酶谱法显示EGCG(5，10，20μg/ml）能显著抑制HCCLM6细胞中MMP-2和MMP-9的活性；RT-PCR结果表明EGCG(10，20μg/ml）能显著抑制HCCLM6细胞中MMP-2和MMP-9的mRNA水平。推测MMP-2和MMP-9的活性的降低可能与EGCG抑制HCCLM6细胞转移有关。本研究显示EGCG具有抑制肿瘤细胞转移的功能，提示EGCG可能成为一个治疗肝癌的潜在药物。 最后，为进一步探讨EGCG对HCCLM6细胞的抑制作用机制，本课题采用蛋白质组学方法，对EGCG作用HCCLM6细胞前后进行蛋白质组学分析，发现了35个蛋白点在EGCG处理后发生可重复的显著变化，其中11个蛋白点被上调，24个被下调。选4个变化明显的差异蛋白点，经MALDI-TOF/MS分析，利用得到的质谱数据进行肽指纹图谱分析后，被鉴定为FUBP1, HSPB1, NPM和CH60。已有文献报道这四种蛋白与细胞的转移和凋亡有关，故推测EGCG通过下调FUBP1、HSPB1、CH60的表达、上调NPM的表达来引起HCCLM6细胞凋亡和（或）抑制细胞的转移。蛋白质组学研究结果印证了前期实验结果对EGCG对于肝癌细胞作用机制的推测。
【关键词】：肝肿瘤 表没食子儿茶素没食子酸酯 凋亡 转移 蛋白质组学
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 摘要9-11
• Abstract11-13
• 前言13-14
• 第一部分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)诱导人肝癌细胞和正常肝细胞凋亡功效的比较14-30
• 材料14-16
• 1 实验材料14-16
• 1.1 细胞株14
• 1.2 药物与试剂14-15
• 1.3 器材15-16
• 方法16-21
• 2 实验方法16-21
• 2.1 细胞培养16
• 2.2 MTT 法检测 EGCG 对细胞生长的抑制作用16-17
• 2.3 细胞核形态的观察17
• 2.4 流式细胞术检测细胞周期17-18
• 2.5 细胞凋亡测定18-19
• 2.6 线粒体膜电位的测定19
• 2.7 Western-blotting 测蛋白表达19-20
• 2.8 统计学分析20-21
• 结果21-27
• 讨论27-29
• 小结29-30
• 第二部分 表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对人肝癌细胞转移的抑制作用30-42
• 材料30-31
• 1 实验材料30-31
• 1.1 细胞株30
• 1.2 试剂30
• 1.3 器材30-31
• 方法31-36
• 2 实验方法31-36
• 2.1 细胞培养31
• 2.2 侵袭实验31
• 2.3 迁移实验31-32
• 2.4 明胶酶谱法测金属蛋白酶的活性32
• 2.5 RT- P C R32-34
• 2.6 免疫荧光技术检测肝癌细胞 VEGF 和 OPN 的表达34-35
• 2.7 统计学分析35-36
• 结果36-40
• 讨论40-41
• 小结41-42
• 第三部分 表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对人肝癌细胞蛋白质组学的影响42-49
• 材料42-43
• 1 实验材料42-43
• 1.1 细胞株42
• 1.2 药物与试剂42
• 1.3 器材42-43
• 方法43-45
• 2 实验方法43-45
• 2.1 细胞培养43
• 2.2 分组43
• 2.3 细胞全蛋白样品制备43
• 2.4 蛋白浓度测定43
• 2.5 蛋白质的纯化43
• 2.6 等电聚焦电泳43-44
• 2.7 SDS-PAGE 电泳44
• 2.8 凝胶的银染44
• 2.9 凝胶图像的分析44
• 2.10 质谱分析44-45
• 结果45-47
• 讨论47-48
• 小结48-49
• 结论49-50
• 参考文献50-55
• 综述55-63
• 参考文献59-63
• 附录63-64
• 致谢64-65

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 李叶云,江昌俊,王秀丽;茶多酚的生物活性及药理学研究进展[J];安徽中医学院学报;2002年05期

2 黄燕,黄黛;VEGF、MMPs与肿瘤转移[J];承德医学院学报;2005年03期

3 孙辑凯;黄立军;常东胜;;EGCG抑制肺癌细胞增殖及其机制的研究[J];第四军医大学学报;2007年16期

4 黄沁园;黄敏丽;何纯刚;;表没食子儿茶素没食子酸酯抑制血管生成的研究进展[J];广东医学;2009年02期

5 叶馨蔚;罗一帆;潘顺顺;曾琼;苗爱清;庞式;孙世利;;EGCG抗癌分子相关机理研究进展[J];广东农业科学;2012年23期

6 刘晓萍;文小玲;邹少娜;王强;陈晓艳;罗招阳;;EGCG活化线粒体途径诱导人胃癌细胞凋亡[J];南华大学学报(医学版);2007年04期

7 刘重元;王强;罗招阳;;EGCG影响NF-κB入核后的周期阻滞效应[J];南华大学学报(医学版);2009年01期

8 肖华;时开网;曹红勇;;EGCG对胰腺癌细胞PANC-1生长的抑制作用及机制[J];实用临床医药杂志;2010年07期

9 赵志成;庄莉;贾长库;郑树森;;EGCG抑制肝癌细胞株HepG2增殖及HIF-1α/VEGF的表达[J];中国病理生理杂志;2010年04期

10 华德兴;彭青;曾香连;姚芬;钱元恕;;绿茶及其提取物抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌作用研究[J];中国抗生素杂志;2010年03期

本文编号：796678