ABO血型基因分型方法的建立及其在新生儿溶血病早期诊断中的初步应用

发布时间：2017-09-27 13:01

  本文关键词：ABO血型基因分型方法的建立及其在新生儿溶血病早期诊断中的初步应用

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【摘要】：ABO血型系统是人类历史上发现的第一个血液遗传标记系统。早在20世纪90年代初,Yamamoto等人就报道了其编码基因的完整序列,为ABO血型基因型分子水平检测奠定了理论基础。当前临床多使用血清学方法,根据红细胞上对应抗原有无鉴定ABO血型表型,但该方法无法判断血型基因型。近年来,分子生物学及实验技术领域的研究突飞猛进,对ABO血型基因型的研究亦广泛开展,为使ABO血型基因型更好的服务于临床,本研究建立和优化了两种ABO血型基因分型方法,并尝试应用于新生儿溶血病的早期诊断。 建立了一套基于扩增阻滞突变系统聚合酶链式反应(ARMS-PCR)的ABO血型基因分型方法,该方法通过一步PCR反应可鉴定7种常见ABO血型基因型亚型(A1、A1Ⅴ、 A2、B、O1、O1Ⅴ和O2)、28种基因型亚型组合,从基因组DNA提取到获得基因检测结果约需3-4小时。本研究还建立了一套基于环介等温扩增(LAMP)的ABO血型基因分型方法,通过一步恒温反应可鉴定6种常见ABO血型的基因型组合(AA、AO、BB、 BO、OO和AB),从基因组DNA提取到获得基因分型结果约需1-2小时。同时,根据ABO血型遗传规律,将本研究建立的ABO血型基因分型方法应用于新生儿溶血病早期诊断研究中,并通过DNA测序对检测结果进行验证,结果100%吻合。 对比两种方法,ARMS-PCR法操作简便,成本低,对实验条件要求低,适于在普通分子实验室或医院检验使用；LAMP法操作简便,快捷,但成本相对较高,适于大型实验室或有快速诊断要求的医院使用。
【关键词】：ABO血型 基因分型 ARMS-PCR LAMP 新生儿溶血病
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R722.18
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 目录6-10
• 第一章 绪论10-18
• 1 ABO血型系统概述10-13
• 1.1 ABO血型研究起源及分布10-11
• 1.2 ABO血型基因简介11-12
• 1.3 ABO血型基因多态性12
• 1.4 ABO血型鉴定方法12-13
• 1.4.1 血清学方法12-13
• 1.4.2 基于分子生物学的检测方法13
• 1.4.3 其他ABO血型鉴定方法13
• 1.5 ABO血型基因型鉴定意义13
• 2 新生儿溶血病概述13-15
• 2.1 发病机制14
• 2.2 常见发病类型14
• 2.3 诊断方法14-15
• 2.5 早期诊断意义15
• 3 论文立题意义15-18
• 第二章 基于ARMS-PCR法检测ABO血型18-40
• 1 ARMS-PCR法基本原理18-19
• 2 检测位点选取19
• 3 实验样本、试剂及仪器19-21
• 3.1 实验样本19-20
• 3.2 主要试剂20
• 3.3 主要仪器20-21
• 4 实验方法21-26
• 4.1 基因组DNA提取21-22
• 4.2 引物设计22-23
• 4.3 反应体系优化及确定23-25
• 4.3.1 引物用量优化23
• 4.3.2 模板用量优化23-24
• 4.3.3 退火温度选择24
• 4.3.4 扩增循环数选择24
• 4.3.5 重复性验证24-25
• 4.4 优化后实验过程25-26
• 4.4.1 准备阶段25
• 4.4.2 反应体系配制25
• 4.4.3 PCR扩增25
• 4.4.4 结果鉴定25-26
• 5 结果与分析26-34
• 5.1 可检测的ABO基因型亚型26-27
• 5.2 引物用量确定及分析27-29
• 5.3 模板用量确定及分析29-30
• 5.4 退火温度确定及分析30-31
• 5.5 循环数确定及分析31-33
• 5.6 重复性验证结果及分析33-34
• 6 新生儿溶血病早期诊断34-37
• 6.1 检测方法34-35
• 6.2 临床样本筛选35
• 6.3 临床样本检测35-36
• 6.4 结果与讨论36-37
• 7 本章小结37-40
• 第三章 基于LAMP技术检测ABO型40-58
• 1 LAMP技术基本原理40-43
• 1.1 LAMP法引物40-41
• 1.2 扩增原理41-43
• 1.2.1 循环模板合成阶段41
• 1.2.2 循环模板扩增阶段41-43
• 2 检测位点选取43
• 3 实验样本、试剂及仪器43-45
• 3.1 实验样本43-44
• 3.2 主要试剂44
• 3.3 主要仪器44-45
• 4 实验方法45-50
• 4.1 基因组DNA的提取45-46
• 4.2 引物设计46-47
• 4.3 反应体系优化及确定47-49
• 4.3.1 反应温度优化47
• 4.3.2 Mg~(2+)浓度优化47-48
• 4.3.3 甜菜碱浓度优化48
• 4.3.4 dNTPs浓度优化48-49
• 4.3.5 实时或目视化检测49
• 4.3.6 重复性验证49
• 4.4 优化后实验过程49-50
• 4.4.1 准备阶段49
• 4.4.2 反应体系配制49-50
• 4.4.3 恒温扩增50
• 4.4.4 结果检测50
• 5 结果与讨论50-56
• 5.1 可检测的ABO基因型50-51
• 5.2 反应温度确定及分析51-52
• 5.3 Mg~(2+)浓度确定及分析52
• 5.4 甜菜碱浓度确定及分析52-53
• 5.5 dNTPs浓度确定及分析53-54
• 5.6 实时或目视化检测结果及分析54-55
• 5.7 重复性验证结果及分析55-56
• 6 本章小结56-58
• 全文总结58-60
• 参考文献60-68
• 附录68-70
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果70-72
• 致谢72

【参考文献】

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本文编号：929800