小儿神经母细胞瘤血清特异性蛋白的筛选与鉴定

发布时间：2017-10-02 17:37

  本文关键词：小儿神经母细胞瘤血清特异性蛋白的筛选与鉴定

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【摘要】：研究背景 神经母细胞瘤（neuroblastoma,NB）最常见的颅外恶性实体肿瘤之一，占所有儿童肿瘤8%～10%，一些高发地区如法国、以色列瑞士、新西兰等的年发病率达11/100万(0～15岁)，美国为25/100万，中国和印度的报道均低于5/100万。NB是起源于胚胎神经嵴的交感神经元细胞，形态为蓝色小圆细胞，因其早期缺乏明显的临床表现，并且其发生的部位隐匿，很难在疾病早期诊断，且肿瘤生长速度十分迅速，加上肿瘤恶性程度极高，在疾病早期便可发生多处的转移，在临床表现出多样化，容易被漏诊、误诊，和延误治疗，所以患儿生存率很低。根据肿瘤发生部位、发病年龄以及不同的组织分化程度，临床表现有很大的差异，有一部分肿瘤会转化成良性肿瘤，但是其他部分的患者，将面对艰难的治疗过程和让人绝望的预后。目前，对于婴儿型或早期NB预后有了可喜的改善，遗憾的是，在对大年龄、晚期患儿的预后仍然极差。在诸多可影响NB的因素中，最重要的影响因素是年龄与分期。65%的患儿肿瘤原发于腹腔，大年龄儿童中肾上腺原发占40%，而在婴儿中只占25%。胸腔和颈部也较常见。其余约有10%的病例原发部位不明。极少数有10岁以后发病，多数在5岁发病约占70%。目前对NB的临床诊断主要还是针对可疑部位进行B超、CT及MRI等检查，有转移的患儿，必须行骨髓检查，查找NB细胞；可疑骨转移的患儿，进行X线或者CT检查或者行放射性核素扫描等，肿瘤经皮穿刺取活检，或者术中活检，病理学检查发现小圆形NB细胞，可确诊。生物学特性检测如尿香草扁桃酸(VMA)高香草酸(HVA)显著增高。目前NB的治疗无统一的规范方案和具体措施，治疗方案较为繁复，且仍在完善和探索中。根据INSS所定临床分期和COG风险分组情况来确定治疗方法。手术治疗与放射治疗抑或生物治疗是目前主流治疗方法，预后多与肿瘤的分期呈负相关，由此可见神经母细胞瘤患儿的早期诊断、早期治疗，对提高疗效以及改善预后有着重要作用。目前血清学检查是最简单易行无损伤的检查方式，血清中肿瘤标志物的变化往往会早于影像学的表现。NB病中，单个指标检测阳性率和特异性不高，各个肿瘤标志物联检可提高肿瘤诊断的准确性和灵敏性，NES（神经元特异性烯醇化酶）为目前NB诊断的首选肿瘤标志物，可联合LDH（乳酸脱氢酶）、SF（血清铁蛋白）血清标记物，在神经母细胞瘤临床分期、疗效评价及判断复发等方面提供重要的实验室依据。为了让神经母细胞瘤患儿在早期诊断，及时治疗，我们迫切的需要一种具有高敏感性、高特异性，简单易行的诊断方法。 蛋白质组学是医学科学发展的前沿，国际人类基因组计划已经完成，目前科研人员也在逐渐的完善着蛋白质序列的数据库，将各种质谱技术的串联，用于鉴定蛋白质，常用的搜库软件，具备了快速、准确的、有效的肽段鉴定的能力，进而获得相应的蛋白质信息。1994年提出了蛋白质组学这一概念，马上获得了大量的研究和认可。在大量样本的情况下通过特殊的方法研究蛋白质的特征是蛋白质组学的本质。所有的疾病、任何机体活动，无论是量变还是质变，在蛋白质水平上都会有变化。所有，我们可以应用蛋白组学技术，对机体蛋白质进行检测，发现特异性变化的蛋白质，可以作为一种早期诊断的方法。研究的核心问题是找寻疾病对应的特异性蛋白质，随着蛋白质组学技术的更新发展，多种蛋白质标记物被检测出并加以鉴定。蛋白质组学研究对象包括蛋白与蛋白相互作用、翻译后的修饰、蛋白质的表达水平等，发展以及特殊改变的蛋白质，分析其结构和功能，可作为早期诊断以及预后指标，服务于临床医疗。 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MELDI-TOF-MS）技术，将质谱与色层分析技术完美融合，具有更高的分辨率，更先进的软电离技术，增强了分离能力，使待测分子不会产生碎片，基质利用亲和力来捕获疏水性、亲水性、离子螯合和与金属结合的蛋白质或者其它分子，以获取所需蛋白质的分子量、等电点、糖基化位点和磷酸化位点等重要资料。在蛋白质谱技术中，可以对微量的样本血清进行分析，目标蛋白多集中在10kDa内，样品的离子在仪器场中的飞行时间不同，经过软件处理可形成模拟谱图，直观的显示样品中各种蛋白质的分子量和含量。将疾病组与对照组的谱图进行比较，很直观的就可以发现和捕获疾病特异性相关蛋白质。 本实验应用MELDI-TOF-MS技术检测神经母细胞瘤患儿术前血清与健康体检童儿血清中的蛋白，筛选出特异性表达的非炎性蛋白质，并应用质谱技术及数据库搜索对筛选出的特异性蛋白质进行鉴定，通过对神经母细胞瘤患儿的术前病例血清及健康儿童血清中对蛋白质定性的比较分析，筛选并鉴定神经母细胞瘤患儿血清中非炎性特异性表达的蛋白质。 研究目的 筛选并鉴定小儿神经母细胞瘤血清非炎性特异性蛋白，构建更为完善的早期诊断血清蛋白质指纹图谱模型。为下步对神经母细胞瘤的诊断及治疗打下前瞻。 材料与方法 材料：血清样本收集与处理 收集郑州大学第一附属医院2011年至2013年神经母细胞瘤患儿术前血清样本30例，其中男18例，女12例，年龄3~13岁，平均6.0+0.5岁，收集正常体检儿童血清30例，与神经母细胞瘤患儿年龄、性别相匹配。全身炎症反应综合(SIRS)患儿20例，男12例，，女8例，平均年龄3.5+0.1岁。所有血清标本均是清晨空腹抽取室温静置0.5-1h，3000r/min离心15min，取上清液后，立即放入-80℃冰箱保存。 方法：将处理好的血清标本解冻，经过弱阳因子（WCX）磁珠处理，往处理好的样品中添加基质，点在蛋白质芯片板上，编辑读片操作程序，最高分子量设在30000Da，其最佳范围设为2000Da~20000Da，设置相应的参数，调节设置最佳激光能量及检测灵敏度。参数调节完毕后，将芯片板装入质谱仪，利用MELDI-TOF-MS平台，收集数据，应用软件处理数据，得到各样本中的m/z峰，其中差异小于0.3%的考虑为一类。在结果收集完毕后，将不同组间的m/z峰值的数据运用Wilcoxon秩和检验，P值越小，其表达强度的差异就越大，表明这两组不同的样本的差异越有研究意义。肿瘤组与正常组、SIRS组与正常组中均得到两组差异性m/z峰值，范围+0.3%，进而发现在肿瘤血清和正常小儿血清、SIRS患儿与正常组患儿间的差异性蛋白。筛选完毕后，制备胶体，收集肿瘤血清2ml，加入超纯水稀释到5ml，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，分离结束后在对应的分子量轴上切胶，分装至不同的EP管中，根据胶内酶解试剂盒说明书，酶解出目标蛋白。加入提取液后，提取上清液。将上清液添加基质后，在蛋白质芯片板上点样，放入MALDI-TOF/TOF，通过激光轰击，收集肽段序列，然后通过Mascot软件，与SwissProt数据库连接、匹配及比对，最终得到目标蛋白质。 结果 1.神经母细胞瘤血清组与正常对着组的数据经过滤筛选后得出P值小于0.01的m/z峰11个，经过统计学分析，在有显著差异的蛋白质峰任意组合中，应用SVM筛选出预测值的阳性率与阴性率之差（youden指数）最高的组合模型，筛选出m/z位于5920的蛋白质标志物，在神经母细胞瘤术前组高表达(强度为6180.6±2328.0)，正常小儿组明显低表达(强度为419.1±493.0)，差异有统计学意义(P0.01)。 2. SIRS组与对照组数据经过统计学分析，得出P0.01的特异性高表达6个，低表达4个，同样参考youden指数最高的模型，得到m/z位于5747的蛋白质标志物，在炎症组中高表达（强度为514.2±361.3），正常组明显低表达（强度24.6±13.4），差异有统计学意义。 3.通过对两组结果的比较，峰值位于5920的蛋白质在炎症组与正常组的比较结果中，未发现近似值（范围+0.3%），确定肿瘤特异蛋白5920为非炎性蛋白。 4.利用MALDI-TOF/TOF平台对经过分离、纯化、酶解的肽段混合物进行检测，m/z峰位于5920的蛋白质经鉴定为类Apo C-III（类载脂蛋白C-III）. 结论 M/z峰位于5920的蛋白质经鉴定为类Apo C-III，与现行临床常用的NES，LDH，SF等肿瘤标志物可联用，组成完善的血清蛋白质指纹图谱模型，对神经母细胞瘤早期诊断、手术效果及预后监测具有重要意义。Apo C-III在小儿神经母细胞瘤血清中的发现，实验结果证明肿瘤血清中存在类脂化合物，对于后期研究脂类代谢与肿瘤发生、发展的关系具有指导意义。
【关键词】：神经母细胞瘤 蛋白质组学 类载脂蛋白CIII 类Apo C-III
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.4
【目录】：

• 中文摘要4-9
• Abstract9-16
• 中英文缩略词16-17
• 前言17-20
• 材料与方法20-25
• 结果25-29
• 讨论29-35
• 结论35-36
• 参考文献36-39
• 综述39-55
• 参考文献51-55
• 个人简历及在学期间发表的学术论文55-56
• 1 一般情况55
• 2 学习经历55
• 3 在学期间发表学术论文55-56
• 致谢56

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 白先慧;脂肪肝患者血清载脂蛋白CⅢ检测的临床意义[J];广西医学;1997年03期

2 张志泉;俞娟;陈连英;于婷;刘才旺;王惠民;;高甘油三酯血症患者血清载脂蛋白CⅢ含量分析[J];南通大学学报(医学版);2008年01期

3 李仲荣;;神经母细胞瘤的临床诊断与治疗[J];实用儿科临床杂志;2012年23期

4 周琴;罗桐秀;谭玉林;易光辉;;载脂蛋白C-Ⅲ研究进展[J];心血管病学进展;2009年05期

5 赵晋;汤泓;李红霞;;卵巢癌患者术前、术后、复发及化疗过程中血清蛋白质差异表达研究[J];中国实验诊断学;2012年06期

本文编号：960977