抗VEGF治疗对新生血管纤维化的影响

发布时间：2017-10-04 19:47

  本文关键词：抗VEGF治疗对新生血管纤维化的影响

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【摘要】：目的 观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)单克隆抗体Bevacizumab对人视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium, RPE)ARPE-19和脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)纤维化相关因子表达的影响,以探讨抗VEGF治疗是否会影响新生血管纤维化。 方法 采用化学诱导法(CoCl2)建立低氧环境(终浓度200μM)；根据实验需要设定不同培养条件,将ARPE-19细胞和HUVEC细胞分为3组：①正常对照组：细胞常规培养。②低氧组(CoCl2):培养基中加入CoCl2,使终浓度为200μM。③低氧+Bevacizumab组(CoCl2+Bevacizumab):培养基中加入终浓度为200μM的CoCl2及终浓度为0.25mg/ml的Bevacizumab。在上述不同条件下培养6h,12h,24h和48h后收获细胞和上清,采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, Real-time PCR)和酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测ARPE-19及HUVEC的结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)、碱性成纤维细胞因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、转化生长因子-β2(transfoming growth factor β2, TGF-β2)在不同时间点的基因及蛋白表达水平,Real-time PCR和免疫蛋白印迹法(Western blotting)检测两种细胞在上述各时间点基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases2, MMP-2)的基因及蛋白表达水平,分别比较ARPE-19和HUVEC在三种不同培养条件下CTGF、bFGF、TGF-β2和MMP-2表达水平差异。 结果 在ARPE-19细胞中,正常对照组,低氧组以及低氧+Bevacizumab组在6h,12h,24h和48h四个时间点的CTGF、bFGF、TGF-β2和MMP-2mRNA相对表达量如下①CTGF mRNA6h:1.008±0.049,2.539±0.051,4.716±0.130;12h:1.002±0.021,2.183±0.078,3.816±0.107;24h:1.010±0.127,1.849±0.120,3.330±0.141;48h:1.002±0.115,1.485±0.049,2.722±0.035;②bFGF mRNA6h:1.007±0.032,1.476±0.031,3.803±0.047;12h:1.004±0.172,1.561±0.041,3.534±0.028;24h:1.005±0.038,1.227±0.028,2.775±0.179;48h:1.001±0.116,0.965±0.112,2.722±0.060;(3)TGF-β2mRNA6h:1.016±0.078,3.461±0.214,4.636±0.077;12h:1.006±0.117,2.698±0.230,3.713±0.095;24h:1.007±0.163,2.196±0.217,3.048±0.198;48h:1.012±0.156,1.763±0.213,2.754±0.169;④MMP-2mRNA6h:1.013±0.091,1.998±0.117,2.717±0.103;12h:1.009±0.131,1.713±0.162,3.136±0.139;24h:1.021±0.092,1.879±0.117,3.486±0.196;48h:1.014±0.109,1.776±0.113,2.253±0.094。对CTGF、 bFGF、TGF-β2和MMP-2各时间点的mRNA相对表达量分析,低氧组均较正常对照组升高,低氧+Bevacizumab组与低氧组和正常对照组比较,表达量均增加,差异均有统计学意义,P值均小于0.05。ARPE-19细胞中ELISA结果显示四个时间点的CTGF、 bFGF和TGF-β2蛋白低氧组与正常对照组相比表达增加,低氧+Bevacizumab组与低氧组和正常对照组比较表达量均增加,差异均有统计学意义,P值均小于0.05,所测蛋白浓度如下(单位pg/ml)①CTGF6h:31.865±5.395,76.612±5.305,121.044±6.121;12h:84.225±7.165,164.173±4.905,290.827±7.091;24h:119.613±7.887,199.14±7.133,335.957±4.960,48h:95.160±9.851,133.224±8.089,217.872±8.140。②bFGF6h:27.704±4.139,31.003±6.305,89.893±5.120;12h:51.262±6.653,73.997±7.057,171.306±7.914;24h:67.148±5.088,81.759±8.339,116.435±4.096;48h:53.882±7.108,42.192±6.897,104.214±8.105;③TGF-β26h:28.172±6.911,83.559±4.103,121.245±9.003;12h:53.96±5.131,129.203±6.639,191.712±8.106;24h:75.772±4.092,156.453±6.196,220.247±7.014;48h:42.077±6.109,70.344±7.094,117.391±.195。Western blot结果示在四个时间点上,低氧组ARPE-19细胞的MMP-2蛋白表达较正常对照组升高,,低氧+Bevacizumab组与低氧组和正常对照组相比表达升高,差异均有统计学意义,P值均小于0.05。在HUVEC细胞中,正常对照组,低氧组以及低氧+Bevacizumab组在6h,12h,24h和48h四个时间点的CTGF、bFGF、TGF-β2和MMP-2mRNA相对表达量如下①CTGF mRNA6h:1.016±0.072,1.579±0.076,2.915±0.070;12h:1.104±0.073,2.280±0.070,4.357±0.064;24h:1.044±0.092,1.734±0.109,3.177±0.065;48h:0.903±0.089,1.453±0.100,2.371±0.069;②bFGF mRNA6h:0.906±0.056,1.411±0172,3.601±0.084;12h:1.106±0.092,1.623±0.113,4.034±0.106;24h:1.065±0.072,1.333±0.064,3.132±0.080;48h:1.001±0.091,1.171±0.045,2.862±0.096;③TGF-p26h:0.901±0.099,2.964±0.102,3.169±0.057;12h:0.981±0.052,2.392±0.082,4.441±0.107;24h:1.019±0.104,2.026±0.070,3.112±0.102;48h:1.072±0.123,1.762±0.120,2.685±0.080;④MMP-2mRNA6h:1.033±0.086,2.097±0.083,2.597±0.101;12h:0.933±0.092,2.879±0.125,3.298±0.087;24h:1.010±0.085,2.003±0.098,2.397±0.088;48h:1.089±0.130,1.971±0.099,2.173±0.079。对CTGF、 bFGF、TGF-β2和MMP-2各时间点的mRNA相对表达量分析,低氧组均较正常对照组升高,低氧+Bevacizumab组与低氧组和正常对照组比较,表达量明显增加,差异均有统计学意义,P值均小于0.05。HUVEC细胞中ELISA结果显示四个时间点的CTGF、 bFGF和TGF-β2蛋白低氧组与正常对照组相比表达增加,低氧+Bevacizumab组与低氧组和正常对照组比较表达量也是增加的,差异均有统计学意义,P值均小于0.05,各组蛋白浓度如下(单位pg/ml)①CTGF6h:25.716±5.042,36.218±4.309,76.069±6.069;12h:53.627±6.563,73.884±6.092,219.870±7.867;24h:79.618±4.873,101.451±7.104,156.523±4.516;48h:61.575±5.844,77.962±4.539,111.317±4.938;②bFGF6h:11.967±6.985,16.635±7.203,42.343±6.941;12h:23.126±5.098,28.626±8.943,80.562±4.757;24h:34.153±7.126,40.125±7.986,103.971±4.145;48h:18.268±6.108,21.112±9.097,45.429±7.861;③TGF-p26h:17.523±4.529,57.632±8.623,68.094±7.084;12h:31.581±3.983,76.225±8.095,99.113±8.957;24h:43.415±4.079,90.462±9.106,126.457±7.627;48h:26.947±5.126,41.665±7.516,67.413±8.112。Western blot结果示HUVEC细胞中四个时间点的MMP-2蛋白表达低氧组较正常对照组升高,低氧+Bevacizumab组与低氧组和正常对照组相比表达升高,差异均有统计学意义,P值均小于0.05。 结论 在低氧环境下Bevacizumab可以上调ARPE-19及HUVEC的纤维化相关因子CTGF, bFGF, TGF-02,MMP-2等的表达,因此,玻璃体腔注射Bevacizumab有可能加重组织纤维化而影响抗VEGF治疗的效果,但这些与纤维化相关的细胞因子之间的相互作用以及是否还有其他因子的参与如炎症因子,都有待进一步的探讨和研究。
【关键词】：Avastin 新生血管纤维化 视网膜色素上皮细胞 脐静脉内皮细胞 细胞因子
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R722.1
【目录】：

• 附件4-7
• 摘要7-11
• Abstract11-15
• 主要符号表15-16
• 引言16-18
• 第一章 实验材料和方法18-33
• 1.1 实验材料18-22
• 1.2 实验方法22-33
• 第二章 实验结果33-46
• 2.1 细胞培养33-34
• 2.2 MTT法细胞活性检测34-35
• 2.3 Realtime PCR法在基因水平检测CTGF、bFGF、TGF-β_2和MMP-2表达35-40
• 2.4 酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)在蛋白水平检测CTGF、bFGF、TGF-β_2的表达40-44
• 2.5 免疫印迹法(western blot)检测MMP-2蛋白的表达44-46
• 第三章 讨论46-48
• 第四章 结论48-49
• 参考文献49-53
• 综述53-62
• 参考文献58-62
• 攻读学位期间的研究成果62-63
• 致谢63

【参考文献】

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1 易伟华,魏锐利,蔡季平,李玉莉;血管内皮生长因子和转化生长因子β_1在眼眶海绵状血管瘤的表达及意义[J];国际眼科杂志;2004年02期

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本文编号：972524