MSH2基因、端粒酶及NADPH氧化酶与肿瘤细胞辐射敏感性的相关研究

发布时间：2017-10-14 12:31

  本文关键词：MSH2基因、端粒酶及NADPH氧化酶与肿瘤细胞辐射敏感性的相关研究

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【摘要】：目的:研究肿瘤细胞内MSH2基因表达、端粒酶及NADPH氧化酶对辐射敏感性的影响并探讨其作用机制。研究内容包括四方面:第一,X射线及重离子辐照对人肿瘤细胞MSH2表达及生物学效应的影响;第二,抑制MSH2表达提高人肿瘤细胞碳离子辐射敏感性;第三,MSH2下游基因hTERT对人肿瘤细胞重离子辐射敏感性的影响;第四,内源性活性氧参与调节肿瘤细胞重离子辐射敏感性。材料和方法:碳离子束和X射线辐照人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞,应用MTT实验分别对辐照后细胞进行细胞毒性检测,采用克隆形成实验检测细胞存活率,应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,RT-PCR、Western Blotting、激光共聚焦显微镜检测MSH2、端粒酶各亚基、PGC-1a、NOX家族蛋白的表达;合成特异性MSH2-siRNA寡核苷酸,转染HepG2细胞,抑制MSH2的表达,观察下调MSH2基因后肝癌HepG2细胞辐射敏感性的变化;用端粒酶抑制剂MST-312处理人乳腺癌MCF-7细胞,应用相应试剂盒检测端粒酶活性,线粒体总量、线粒体DNA拷贝数量和线粒体膜电位及细胞衰老;利用NADPH氧化酶抑制剂diphenyliodonium(DPI)处理人肝癌HepG2细胞,应用荧光探针DCFH-DA检测活性氧水平,激光共聚焦显微镜观察p47phox亚基与NOX2在细胞内的分布及数量,分析重离子辐照后NADPH氧化酶在辐射敏感性中的作用。结果:第一,X射线和碳离子辐照人肝癌HepG2细胞后,随辐射剂量增加存活率逐渐降低,存在剂量依赖性,并且高LET的碳离子明显比X射线对人肝癌HepG2细胞的杀伤能力强。经重离子辐照后,2 h便出现MSH2表达,随着时间延长,MSH2表达逐渐增加,至6 h时,这种修复作用似接近高峰,随着时间的推移,MSH2的表达逐渐减小,在12 h时仍有表达,但24 h几乎看不到表达,推测其行使DNA损伤修复功能的高峰可能在6 h-12 h。第二,转染MSH2 siRNA后,MSH2表达下降,人肝癌HepG2细胞对重离子辐射敏感性提高,并出现G2/M期阻滞,随后sub-G1明显升高;随剂量和时间延长,P53蛋白表达也逐渐增高。第三,人乳腺癌MCF-7细胞端粒酶活性在照射4 Gy、10 Gy受到抑制,比较照射前及照射后hTERT mRNA在辐照后表达下降,这一结果进一步由real-time PCR在mRNA水平和Western Blotting在蛋白水平证实,差异有统计学意义。2μM hTERT抑制剂联合2-4 Gy射线处理MCF-7后,克隆存活率与单独辐照组明显减少。在2 Gy照射时克隆存活率为46%,经MST-312处理后,克隆存活率进一步减少到17%。单独用重离子辐照,可以使细胞在辐照24 h后出现G2/M期阻滞,48 h后有所下降,但仍高于对照组。随着加入MST-312,G2/M向G1/S转换;重离子辐射能够显著影响端粒酶活性,进而抑制MCF-7线粒体的正常功能。并通过降低PGC-1a表达介导MCF-7的老化。第四,4 Gy重离子辐照HepG2细胞12 h后,细胞内活性氧明显增多,当应用DPI后,活性氧明显减少。4 Gy重离子辐照HepG2细胞后,p47phox亚基明显增多,给予抑制剂后p47phox亚单位明显减少,并且NOX2的变化与p47phox亚单位一致。NOX家族的大部分蛋白,在重离子辐照1 h后明显上升,并且存在剂量依赖性。NOX2、NOX3表达在4 Gy辐照后比1 Gy辐照后下降的多,说明在低剂量重离子辐射情况下也主要由NOX2,NOX3发挥功能。结论:第一,MSH2在射线损伤修复中起重要作用,下调MSH2的表达可以提高辐射敏感性,这一过程中p53信号通路起重要作用。第二,端粒酶抑制剂MST 312可以增强人乳腺癌细胞MCF-7对重离子的辐射敏感性。第三,碳离子辐照可通过激活NADPH氧化酶产生ROS,从而增强重离子的辐射敏感性。
【关键词】：MSH2基因 碳离子束 辐射敏感性 DNA损伤修复 NADPH氧化酶 端粒酶
【学位授予单位】：中国科学院研究生院(近代物理研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.55
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-16
• 第一章 引言16-33
• 1.1 概述16-17
• 1.2 辐射敏感性的相关因素17-24
• 1.2.1 DNA的损伤与修复17-20
• 1.2.2 端粒及端粒酶20
• 1.2.3 抗氧化酶水平20-22
• 1.2.4 细胞周期调控22-23
• 1.2.5 细胞凋亡23
• 1.2.6 其它23-24
• 1.3 DNA损伤修复相关蛋白24-28
• 1.3.1 同源重组途径中主要蛋白24-25
• 1.3.2 非同源末端连接途径中的主要蛋白25
• 1.3.3 参与同源重组途径和非同源末端连接途径的蛋白25
• 1.3.4 错配修复家族蛋白25-28
• 1.4 错配修复基因MSH2的结构和功能28-32
• 1.4.1 MSH2的结构28-29
• 1.4.2 MSH2在肿瘤细胞中表达29
• 1.4.3 MSH2在DNA损伤修复中的作用29
• 1.4.4 MSH2在肿瘤细胞凋亡中的作用29-30
• 1.4.5 MSH2与端粒酶30-31
• 1.4.6 MSH2与ROS31-32
• 1.5 研究目的及意义32-33
• 第二章 X射线及重离子辐照对HepG2细胞MSH2表达及生物学效应影响33-50
• 2.1 实验目的33-34
• 2.2 实验材料与方法34-40
• 2.2.1 实验材料34
• 2.2.2 实验方法和步骤34-40
• 2.3 实验结果40-48
• 2.3.1 形态学变化40-42
• 2.3.2 细胞存活曲线42-44
• 2.3.3 细胞周期44-45
• 2.3.4 MSH2参与重离子辐照后肝癌HepG2细胞核中DNA损伤修复45-47
• 2.3.5 mRNA水平上MSH2表达的差异47
• 2.3.6 蛋白水平上MSH2表达的差异47-48
• 2.4 讨论48-50
• 第三章 抑制MSH2表达提高HepG2细胞碳离子辐射敏感性50-65
• 3.1 实验目的50-51
• 3.2 实验材料与方法51-55
• 3.2.1 实验材料51
• 3.2.2 寡核苷酸合成51
• 3.2.3 分组51-52
• 3.2.4 转染52
• 3.2.5 siRNA抑制MSH2表达效果检测52-53
• 3.2.6 Western Blotting检测53
• 3.2.7 辐照53
• 3.2.8 周期检测53
• 3.2.9 克隆存活检测53-54
• 3.2.10 MTT检测54
• 3.2.11 流式细胞术检测细胞凋亡54
• 3.2.12 Western Blotting检测凋亡蛋白54-55
• 3.2.13 统计学分析55
• 3.3 实验结果55-64
• 3.3.1 realtime PCR检测目的基因表达55-56
• 3.3.2 Western Blotting检测目的基因的表达56-57
• 3.3.3 下调MSH2对HepG2细胞增殖及克隆形成能力的影响57-58
• 3.3.4 MSH2抑制后肝癌HepG2细胞对放射线的敏感性变化58-59
• 3.3.5 MSH2抑制后对肝癌HepG2细胞存活率的影响59-61
• 3.3.6 转染细胞的周期检测61-62
• 3.3.7 MSH2抑制后细胞凋亡的变化62-63
• 3.3.8 p53信号通路的作用63-64
• 3.4 讨论64-65
• 第四章 端粒酶活性通过线粒体影响癌细胞重离子辐射敏感性65-75
• 4.1 实验目的65
• 4.2 实验材料与方法65-69
• 4.2.1 实验材料65-66
• 4.2.2 实验方法66-69
• 4.3 实验结果69-73
• 4.3.1 重离子辐射引起hTERT下调，端粒酶活性被抑制69
• 4.3.2 端粒酶抑制剂使人乳腺癌MCF-7 细胞辐射性敏感性增加69-71
• 4.3.3 重离子在端粒酶抑制剂作用下细胞周期的再分布71
• 4.3.4 端粒酶活性及重离子辐射影响线粒体功能71-72
• 4.3.5 重离子辐射引起线粒体功能障碍介导的肿瘤细胞老化72-73
• 4.4 讨论73-75
• 第五章 NADPH氧化酶与肝癌细胞HepG2重离子辐射敏感性关系75-82
• 5.1 实验目的：75
• 5.2 实验材料与方法75-77
• 5.2.1 主要材料75
• 5.2.2 主要试剂75-76
• 5.2.3 细胞辐照76
• 5.2.4 Western Blotting检测76
• 5.2.5 活性氧检测76-77
• 5.2.6 细胞生存分析77
• 5.2.7 激光共聚焦显微镜77
• 5.2.8 统计学分析77
• 5.3.结果77-80
• 5.3.1 NADPH氧化酶参与重离子诱导的细胞死亡77-78
• 5.3.2 NADPH氧化酶介导重离子辐射细胞内ROS的产生78-79
• 5.3.3 ~(12)C~(6+) 诱导细胞膜p47~(phox)转位激活NADPH氧化酶79
• 5.3.4 重离子上调NOX的表达79-80
• 5.4 讨论80-82
• 第六章 结论与展望82-85
• 6.1 结论82
• 6.2 展望82-85
• 参考文献85-99
• 缩写词表99-101
• 作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果101-102

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 肖国青;张红;李强;宋明涛;詹文龙;;中国科学院近代物理研究所重离子束治癌进展[J];原子核物理评论;2007年02期

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本文编号：1031097