天然产物对急性放射性肠损伤的防护作用与抑制肿瘤干细胞标志物ALDH1A1作用研究

发布时间：2018-03-15 23:38

本文选题：6-姜烯酚　切入点：放射性肠损伤　出处：《北京协和医学院》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：放射性肠损伤是腹腔局部放疗、盆腔放疗和造血干细胞移植预处理的大剂量放疗中常见的副作用之一。放射性肠损伤不仅严重影响患者的生活质量,而且在某些情况下可能危及生命。之所以患者在接受高剂量的急性辐射或累积剂量的辐射会引起各种胃肠道损伤,主要是因为以下三点原因,第一点是因为小肠的组织通常含有具有高增殖活性的细胞,如小肠干细胞等,该细胞对放射线及其的敏感;第二点,在临床上采用的剂量往往与导致小肠损伤所需的剂量非常接近,这使得在治疗过程中,肠道组织难免会受到放射所引起的损伤;第三点,是因为小肠位置的特殊性,易在腹部放疗中意外受到照射。放射性肠损伤的主要症状包括腹痛,粘液血便,肛门坠痛,里急后重、排便困难等症状。放射性肠炎轻者症状可耐受,并能自行痊愈,但重者症状可持续很长时间,并伴有出血,狭窄或形成肠瘘,甚至导致患者死亡。电离辐射产生一系列活性氧自由基,进一部进攻DNA使其断裂后,未得到及时DNA修复的细胞,便会引发凋亡通路的激活,细胞程序性死亡。肠道受到照射后引起的肠上皮细胞凋亡,导致绒毛剥离,粘膜屏障破坏和粘膜炎症。当粘膜屏障受到破坏时,会将肠道转变为促炎器官,向循环中释放促炎因子和其他炎症介质。更为重要的是,肠道粘膜屏障的破坏,还会使得肠道内的细菌从肠腔转移到体循环中,并释放内毒素,引起胃肠道炎症反应,严重的全身性炎症反应会引起多脏器衰竭,甚至最终导致个体死亡。姜作为传统中医中常用一味药物之一,已被证明能有效预防放疗引起的恶心呕吐。在动物和人的研究中,食用干姜粉末即使达到每天2.0克,仍具有极低的毒性水平和很高耐受剂量。本课题进一步分析姜油树脂中的有效成分,经过实验鉴定和检索文献,姜油树脂的主要成分为6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚等,其中含量最高的为6-姜烯酚。在近年来的研究中也表明,6-姜烯酚具有抗氧化,抗炎,抗肿瘤等作用。值得注意的是,6-姜烯酚在肠道保护方面的作用引起了我们的注意。本课题组在前期建立了放射性肠损伤模型上,以及前期姜油树脂具有辐射防护作用的基础上,进一步探索姜油树脂的主要成分——6-姜烯酚,是否能为辐射造成的放射性肠损伤提供保护作用。由于生姜原料便宜,来源方便,希望6-姜烯酚可为放射性肠损伤的防治提供一种新的前体化合物。我们首先通过在本实验室前期建立的放射性肠损伤模型的基础上,观察小鼠的存活率,发现6-姜烯酚的预处理改善了照射损伤后的小鼠存活。通过观测小鼠的腹泻程度发现6-姜烯酚的预处理同样改善了照射后小鼠的肠功能。因此,我们进一步探究6-姜烯酚保护肠功能的更多细节。通过病理实验和TUNEL染色观察到6-姜烯酚的预处理有效的维持了照射损伤后的小鼠的肠道完整性,减少了十二指肠照射后的凋亡现象。通过一系列的微生物实验,我们还发现6-姜烯酚减少了腹部照射后的小鼠体内的细菌易位和内毒素水平。通过免疫组化技术和体外构建氧化应激模型,我们发现,6-姜烯酚可以减弱辐射引起的ROS水平,并抑制了肠道炎症。综合以上实验,我们推断,6-姜烯酚的潜在的放射防护作用可能是由于6-姜烯酚抗氧化作用和抗炎性质,从而减轻了对胃肠道的辐射毒性。根据近年来的统计数据表明,肺癌是人类面临的最严重的健康问题之一,是全世界因癌症导致死亡的主要原因,每年因肺癌死亡人数超过100万人。在中国,肺癌同样也是肿瘤相关死亡的主要原因。在新诊断的肺癌患者中,大约85%为非小细胞肺癌。尽管新型的靶向药物和化疗方案有所进展,但其仍然具有较高的复发率高达30～50%,患者因非小细胞肺癌的死亡率仍然很高,5年的生存率总体保持在7～12%左右。这些高死亡率是因为在放疗或者化疗后,残留的肺癌细胞,其特征与干细胞相似,被定义为肿瘤干细胞。这些细胞处在静息阶段,具有自我更新的潜能,和对化疗和放疗具有抗性,从而导致治疗失败。植物来源的天然产物由于其副作用小,越来越多的研究试图从天然产物中发现新的药物。在本研究中,针对山竹子素,这种从印度藤黄的干果皮中提取出来的一种黄色晶体化合物进行深入研究。在近年来,关于山竹子素的研究表明,该化合物除了具有抗癌活性外,还有广泛的抗炎,抗氧化和抗菌活性。最近的报道中,山竹子素可以促进肿瘤细胞对化疗药物敏感。例如山竹子素能增强人类头颈癌细胞对顺铂药物敏感性,以及增强人类胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性。由于肿瘤的干细胞样细胞具有多药耐药性的特点,本研究探索山竹子素是否有希望作为靶向肿瘤干细胞的治疗药物。在本研究中,首先观察山竹子素对不同非小细胞肺癌细胞系的细胞毒性。意外的发现A549细胞较其他非小细胞肺癌细胞系对山竹子素更为敏感。经查阅文献和本课题实验的验证,A549细胞中高表达乙醛脱氢酶1A1(ALDH1A1),ALDH1A1对维持A549细胞系的肿瘤干细胞特性起到至关重要的作用。由于肿瘤干细胞具有自我更新和迁移的能力,采用肿瘤球形成和细胞迁移的检测。结果发现,山竹子素抑制了 A549细胞的肿瘤球的形成和细胞的迁移,具有潜在的抑制肿瘤干细胞特性的能力。山竹子素对于肿瘤干细胞特征的分子机制的研究,通过筛选一系列肿瘤干细胞标志物发现,在山竹子素处理后,ALDH1A1的转录水平和蛋白水平显著下调。基于山竹子素抑制了 ALDH1A1的转录,通过检索ALDH1A1启动子序列发现ALDH1A1的启动子区的-75到-71bp含有CCAAT框,是转录因子C/EBPβ的结合区域。采用染色质免疫共沉淀实验表明,山竹子素抑制了 C/EBPβ与ALDH1A1启动子的结合。进一步结果表明,山竹子素通过促进了 DDIT3蛋白的转录和表达,使得DDIT3与C/EBPβ形成的蛋白复合物增多,从而抑制了 ALDH1A1的转录。在体内实验中,山竹子素同样抑制了 A549移植瘤小鼠的肿瘤组织生长。通过对小鼠肿瘤组织进行免疫组化染色,山竹子素抑制了肿瘤组织中ALDH1A1的表达,并促进了 DDIT3的表达。目前的研究结果表明,山竹子素可能为高表达的ALDH1A1的非小细胞肺癌肿瘤的治疗提供一种潜在天然产物药物。然而,进一步的临床前研究和临床试验仍需要继续探索。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R730.55

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