携载CA-125抗体的超声纳米泡在靶向诊断卵巢癌中的实验研究

发布时间：2018-04-27 16:30

本文选题：靶向超声纳米泡 + CA-125　；参考：《广西医科大学》2016年博士论文

【摘要】：目的:以CA-125抗体作为配体,制备一种靶向卵巢癌的新型超声纳米泡造影剂,鉴定其理化特性及其对卵巢癌高表达CA-125的OVCAR-3细胞的靶向性,并探讨该造影剂对卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的特异增强显像效果,以期建立敏感的实验性卵巢癌超声早期诊断方法。方法:1.非靶向及靶向超声纳米泡造影剂的制备:将一定比例的DPPC、DPPA、DPPE和DSPE-PEG-COOH与氯仿、Pluronic L10溶液、甘油等混合均匀,采用干燥法、机械振荡法等,制备非靶向超声纳米泡造影剂。通过EDC与NHS将CA-125抗体与非靶向超声纳米泡造影剂连接,制备靶向卵巢癌的超声纳米泡造影剂。2.非靶向及靶向超声纳米泡造影剂物理性质评价:DLS检测仪检测靶向及非靶向超声纳米泡的粒径大小范围、分散度;并用超声诊断仪检测靶向超声纳米泡体外超声造影显像效果。检测三组不同温度下(4℃组、25℃组、37℃组)靶向超声纳米泡在制备后三天内的稳定性及超声造影显像效果。模拟体内环境下,分别检测靶向及非靶向超声纳米泡的稳定性。3.靶向超声纳米泡造影剂与二抗的结合试验:往非靶向及靶向超声纳米泡分别加入带有绿色荧光的二抗MUC16 SAB,于4℃下透析30min,离心两次后,取上清液。用荧光显微镜分别观察靶向及非靶向超声纳米泡表面荧光二抗的附着情况,从而了解靶向超声纳米泡与抗体的结合情况。4.靶向超声纳米泡造影剂的体外结合试验:选择人卵巢癌ovcar-3细胞(对ca-125呈阳性表达)及skov-3细胞(对ca-125呈阴性表达)体外无菌条件下分别培养传代,在第3-4代细胞生长旺盛期,分别将ovcar-3细胞和skov-3细胞固定。将固定好的ovcar-3细胞分为a组、b组,skov-3细胞分为c组、d组。a,c组加入带有绿色荧光的非靶向超声纳米泡造影剂,b,d组加入带有绿色荧光的靶向超声纳米泡造影剂,使纳米泡与细胞充分反应3h,用pbs洗涤4次。即刻用荧光显微镜分别观察靶向及非靶向超声纳米泡在体外分别与卵巢癌ovcar-3细胞及skov-3细胞的结合情况,从而了解靶向超声纳米泡与靶标的结合情况。5.靶向超声纳米泡造影剂的体内应用试验:人卵巢癌ovcar-3细胞及skov-3细胞体外无菌条件下培养传代,在第3-4代细胞生长旺盛期,balb/c雌性裸鼠皮下分别接种,分别建立人卵巢癌裸鼠ovcar-3细胞和skov-3细胞动物模型。经裸鼠尾静脉分别注入携带ca-125抗体的靶向超声纳米泡、间隔两天后再分别注入非靶向超声纳米泡造影剂,在造影前15秒开始采集图像,连续采集10min动态图像。绘制时间-强度曲线,对比分析同种细胞同一肿瘤实质分别注入非靶向及靶向超声纳米泡后超声造影峰值强度、达锋后1min、2min和5min超声造影的增强强度及强度比值(同一肿瘤,靶向超声纳米泡强度值/非靶向超声纳米泡强度值)及两种不同超声纳米泡的衰减斜率。6.病理检查:一周后,经裸鼠尾静脉注入带有绿色荧光的靶向超声纳米泡造影剂,15min后将动物处死并切除肿瘤,用oct包埋并放置-80°c保存。将病理组织进行切片并将细胞核经蓝色dapi染色,在荧光显微镜下观察靶向超声纳米泡与人卵巢癌ovcar-3肿瘤组织及skov-3肿瘤组织的结合情况,从而了解靶向超声纳米泡与靶标的结合情况。结果:1.dls检测仪检测靶向与非靶向超声纳米泡的平均粒径大小分别为74.6±16.7nm、66.6±22.0nm,分散度分别为0.208±0.069,0.203±0.020。携载大分子量ca-125抗体后靶向超声纳米泡体外超声造影显像效果显示为点状高回声,细腻均匀。2.不同温度下靶向超声纳米泡的稳定性:4℃组在靶向超声纳米泡制备后第一天~制备后第三天可保持较小粒径,25℃组和37℃组于制备后第二天开始粒径明显增大。体外超声造影显像效果显示,4℃组和25℃组样本于制备后三天内仍可保持较好的超声造影显像效果,而37℃组样本于制备后第一天超声造影显像效果明显下降。3.模拟体内环境下靶向及非靶向超声纳米泡的稳定性:非靶向与靶向超声纳米泡在0-60min、0-4h内的造影增强强度值变化曲线相似。4.靶向超声纳米泡造影剂与二抗的结合试验:荧光显微镜下显示靶向超声纳米泡样本组中可呈现大量绿色荧光,非靶向超声纳米泡样本组中绿色荧光极少,经imagej定量分析,两组绿色荧光值差异具有统计学意义(p0.05),从而说明二抗与靶向超声纳米泡造影剂牢固、特异性地结合在一起。5.靶向超声纳米泡造影剂的体外结合试验:荧光显微镜下,b组(靶向超声纳米泡组)ovcar-3细胞核周围可见大量绿色荧光围绕或黏附,而a组(非靶向超声纳米泡组)ovcar-3细胞核周围未见或仅见极少量绿色荧光。而d组(靶向超声纳米泡组)和c组(非靶向超声纳米泡组),在skov-3细胞核周围未见或仅见极少量绿色荧光。经imagej定量分析结果提示,b组的总超声纳米泡荧光强度与细胞荧光强度比值(超声纳米泡的总荧光强度/细胞的总荧光强度),与其余三组相比,差异均具有统计学意义(p0.05),且卵巢癌ovcar-3细胞表面所结合的靶向超声纳米泡,最高可达该细胞表面所结合的非靶向超声纳米泡的12倍。6.靶向超声纳米泡造影剂的体内应用试验:绘制tic曲线后,对比分析ovcar-3肿瘤细胞组,同一裸鼠肿瘤实质分别注入靶向、非靶向超声纳米泡后峰值强度、达锋后1min、2min和5min超声造影增强的强度比值(同一肿瘤,靶向超声纳米泡强度值/非靶向超声纳米泡强度值)差异均具有统计学意义(p0.05)。该组裸鼠肿瘤注入靶向超声纳米泡、非靶向超声纳米泡后起始相的平均衰减斜率分别为0.39±0.06、0.98±0.20,尽管靶向超声纳米泡起始相的平均衰减斜率低于非靶向超声纳米泡,但是经配对t检验,对比分析该组同一裸鼠肿瘤实质分别注入两种不同超声纳米泡后起始相衰减斜率、终末相衰减斜率差异均没有统计学意义(p0.05)。而对比分析skov-3肿瘤细胞组,同一裸鼠肿瘤实质分别注入靶向、非靶向超声纳米泡后峰值强度、达锋后1min、2min和5min超声造影增强的强度比值(同一肿瘤,靶向超声纳米泡强度值/非靶向超声纳米泡强度值)差异均无统计学意义(p0.05)。对比分析该组同一裸鼠肿瘤实质分别注入两种不同超声纳米泡后起始相衰减斜率、终末相衰减斜率差异均无统计学意义(p0.05)。7.病理检查:荧光显微镜下对ca-125呈阳性表达的卵巢癌ovcar-3细胞核周围可见大量绿色荧光围绕或黏附,而对ca-125呈阴性表达的卵巢癌skov-3细胞核周围未见或仅见极少量绿色荧光。使用imagej定量分析结果显示,ovcar-3肿瘤细胞的总超声纳米泡荧光强度与细胞荧光强度比值明显高于skov-3肿瘤细胞,差异具有统计学意义(p0.05)。结论:1.超声纳米泡造影剂的大小、稳定性及超声显像效果适合作为血管外造影剂。2.通过edc与nhs将ca-125抗体结合到超声纳米泡表面,成功制备靶向超声纳米泡造影剂。连接ca-125抗体后超声纳米泡仍保持小粒径和较高的稳定性。4℃为保存靶向超声纳米泡的最佳温度,于制备后三天仍可保持较小粒径及良好的超声造影显像效果。3.在体外观察靶向超声纳米泡的寻靶能力,发现靶向纳米泡与相应配体结合牢固,携带了CA-125抗体的靶向超声纳米泡在体外能高效、特异性地与CA-125呈阳性表达的人卵巢癌OVCAR-3细胞结合,而与CA-125呈阴性表达的人卵巢癌SKOV-3细胞不能结合或结合率极低。4.携带CA-125抗体的靶向超声纳米泡在动物体内超声造影实验结果表明,靶向超声纳米泡可高效、特异性地聚集在靶区,靶向超声纳米泡可以明显增强CA-125呈阳性表达的人卵巢癌OVCAR-3皮下移植瘤的显像效果,可作为早期诊断卵巢癌的靶向超声造影剂。5.病理切片经荧光显微镜观察并定量分析,结果进一步证实携带了CA-125抗体的靶向超声纳米泡能高效、特异性地与CA-125呈阳性表达的人卵巢癌OVCAR-3肿瘤细胞结合,而与CA-125呈阴性表达的人卵巢癌SKOV-3肿瘤细胞不能结合或结合率极低。
[Abstract]:Objective : To prepare a novel ultrasonic nano - foam contrast agent targeting ovarian cancer by using CA - 125 antibody as ligand , and to evaluate its physical and chemical properties and its targeting to OVCAR - 3 cells expressing CA - 125 in ovarian cancer . The results showed that : 1 . The results showed that : 1 . The results showed that the average particle size of targeted and non - targeted ultrasound nanobubbles was 74.6 卤 16.7nm , 66.6 卤 22.0nm and 0.208 卤 0.069 , 0.203 卤 0.020 respectively .

【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R445.1;R737.31

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