【摘要】：慢性胰腺炎(Chronic Pancreatitis, CP)是指由于各种不同病因引起胰腺组织和功能的持续性损害,其病理特征为胰腺纤维化。随着人们生活方式和饮食结构的改变,CP发病率不断升高。由于CP病程迁延,最终可导致胰管扩张、胰管结石或钙化等不可逆的形态改变,引起反复腹痛及内、外分泌功能降低所致的脂肪泻、糖尿病等,大多数预后不佳,部分病人死于并发症或发展为胰腺癌。及早发现CP征像、准确监测其结构或功能变化,对指导治疗、改善患者的预后具有重要意义。 影像学检查是诊断CP的重要手段,目前临床常用的影像技术对具有胰腺萎缩、钙化、胰管结石、胰管扩张、假性囊肿形成等明显形态学改变的中重度CP,大多能做出准确的诊断,但对形态学改变轻微的早期CP,则很难做出明确诊断。作为分子影像学和代谢组学重要手段的磁共振波谱分析技术(Magnetic Resonance Spectroscopy, MRS)在CP诊断中的应用近年来逐渐受到人们的关注,MRS检测被广泛应用于肿瘤、癫痫、冠心病、感染等疾病的研究,体外研究方法包括液体(如血液、尿液、唾液、乳液、脑脊液、胰液等)高分辨MRS、生物组织块的高分辨魔角旋转氢质子核磁共振波谱(High-resolution Magic Angle Spinning1H Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, HR MAS1H NMR)研究。目前临床使用的磁共振仪可以直接对活体胰腺病变组织进行波谱分析,但由于磁场强度过低,空间分辨率低,获得的代谢物信息少并有误差,诊断价值有限。体外测试的高分辨MRS具有高灵敏度和高分辨率的特性,样品的前处理简单,因此可较方便的应用于慢性胰腺炎的代谢研究。在胰腺疾病应用方面已报道的研究主要包括血液、胰液的磁共振波谱分析和生物组织块的高分辨魔角旋转核磁共振波谱研究。 磁共振扩散加权成像(Diffusion Weighted Imaging, DWI)是反映活体组织中水分子含量和扩散运动状态的功能成像技术。由于CP组织纤维化并伴有血流灌注减少和分泌功能降低,致使CP组织的表观弥散系数(Apparent Diffusion Coefficient, ADC值)与正常胰腺及胰腺癌不同；新近有学者报道ADC值对有症状CP病人的诊断和判断CP严重程度有帮助。作为一种无创伤无辐射的检查方法,磁共振胰胆管成像Magnetic Resonance Cholangiopancreatography (MRCP)能够清晰显示胰胆管的形态表现,现已广泛应用于胰胆管疾病的影像学诊断,但因其对细小分支胰管等细节的显示劣于ERCP,不能敏感反映早期CP胰管改变,胰泌素刺激磁共振胰胆管成像(secretin-enhanced magnetic resonance cholangio-pancreatography, S-MRCP)在CP的早期诊断和外分泌功能改变定量检测方面的应用逐渐受到关注,用胰泌素追踪胰管形态变化和胰腺功能评估可能有助于提高分支胰管异常改变的显示率,从而有助于CP的早期诊断。 本研究通过大部结扎主胰管的方法制作小型猪阻塞性慢性胰腺炎模型,行磁共振MRCP、S-MRCP及DWI成像,以及离体胰腺组织块及血液尿液的高分辨魔角旋转核磁共振质子波谱分析,用病理作为金标准,研究上述方法在评估CP严重程度,尤其是发现早期CP的价值。 第一部分阻塞性慢性胰腺炎小型猪模型的建立及CT观察 目的：建立适合进行影像学研究的慢性胰腺炎(chronic pancreatitis, CP)大动物模型 材料和方法：将39头小型猪随机分为实验组和对照组,实验组27头,对照组12头,对实验组小猪经剖腹进行主胰管大部结扎,从而建立阻塞性慢性胰腺炎模型,对照组为假手术组,仅仅开腹后翻动胰腺及肠道。在造模后第4、8、12周,实验组和对照组分别随机抽取1/3小型猪(实验组9头,对照组4头)行动态CT增强检查,然后处死获取胰腺大体标本后进行大体及镜下病理观察(HE染色及VG染色),以胰腺腺泡萎缩、纤维化程度及炎细胞浸润进行慢性胰腺炎的分级,并观察病理分期与时间之间的关系。 结果：12头对照组小猪全部完成了试验流程,27头实验组小猪中有3头死亡,死亡原因分别为术中麻醉意外、胰瘘致腹腔感染(术后第2周)及胸腹腔感染心包积液(术后第5周),其他24头小猪完成了试验。病理检查表明对照组12头小猪全部为正常(0期),实验组24头小猪病理分期分别为：0期(正常)2头,Ⅰ期(轻度慢性胰腺炎)10头,Ⅱ期(中度)5头,Ⅲ期(重度)7头。CP严重程度与主胰管结扎时间增加而增加(r=0.997,P=0.034)。动态CT增强扫描检查表明,随着CP程度加重,实验猪胰腺实质CT强化值逐渐降低,且达峰时间延长,在注射对比剂后第30s和35s两个时间点,正常胰腺CT强化峰值最高,重度CP组最低,且各期CP之间强化CT峰值有显著统计学差异。 结论：采用主胰管大部结扎法建立小型猪阻塞性慢性胰腺炎模型的成功率高,CP纤维化程度与梗阻时间呈正相关,随着CP程度加重,实验组强化CT值达峰时间延长且峰值降低。 第二部分阻塞性慢性胰腺炎模型的功能性磁共振表现及其与病理的对照研究 目的：探讨实验性阻塞性慢性胰腺炎(CP)胰泌素增强动态胰胆管成像(S-MRCP)及磁共振弥散加权成像(DWI)的表现及其与病理严重程度的相关性。 材料与方法：39头巴马小型猪随机分成两组,实验组27头,正常对照组12头；实验组采用主胰管不全结扎法建立CP模型,对照组开腹仅翻动胰腺及肠道。在造模术后4、8、12周,每组随机抽取1/3实验动物(实验组9头,对照组4头)行S-MRCP扫描。方案为先进行DWI扫描并测量正常及各期CP胰腺ADC值,然后进行MRCP(胰泌素给药前,0min)及静推胰泌素后1、3、5、7、9、11min动态S-MRCP扫描,观测主胰管直径、十二指肠液充盈程度的变化。处死动物,解剖胰腺行大体病理学及镜下观察(HE和VG染色),将影像表现与病理对照。 结果：(1)本实验模型建立成功并获得清晰S-MRCP图像情况：正常对照组11头,轻度CP组8头,中重度CP组11头。(2)主胰管各项指标检测结果：三组主胰管直径胰泌素刺激前后动态变化总体趋势比较差异有统计学意义(F=49.003,P=1.3*10-11)。胰泌素刺激前,胰管基础直径比较,正常组、轻度CP组和中重度CP组主胰管基础直径分别为1.56±0.46mm,2.95±1.170mm,7.41±1.91mm,正常组和轻度CP,轻度和中重度CP主胰管直径差异有统计学意义(P=0.034,1.0*10-7,均0.05)。胰泌素刺激后主胰管最大径比较,正常组(2.39±0.43mm)与轻度CP组(3.63±1.25mm)主胰管最大径差异无统计学意义(P=0.056,0.05),而轻度CP组明显小于中重度CP(7.86±1.87mm)(P=2.4*10-7,0.05)。胰管扩张达峰时间比较,正常组胰管扩张达峰时间(3.00±0.00min)和轻度CP组(2.75±0.71min)差异无统计学意义(P=0.386,0.05),而轻度CP组则早于中重度CP组(3.36±0.81min)(P值为0.039,0.05)。胰管最大变化率比较,三组胰管最大变化率分别为59.84±34.76%,33.1±14.23,6.92±4.41%。正常组胰管最大变化率明显大于轻度和中重度CP(P=0.0024.3*10-6,均小于0.05),轻度组大于中重度CP组(P=0.009,0.05)。(3)十二指肠充盈程度评估结果。胰泌素给药11min后,正常组十二指肠充盈程度与轻度CP组差异无明显统计学意义(P=0.7440.05),而轻度CP十二指肠充盈程度分级明显低于与中重度CP (P=0.001,0.05)。随着CP进展,实验猪胰腺ADC值逐渐降低,但正常胰腺与轻度CP之间无显著统计学差异,轻度与中重度CP胰腺之间有显著统计学差异。 结论：S-MRCP可用于在体、无创的评估胰腺腺泡外分泌功能和导管的排泌功能状态,尤其是主胰管最大扩张率可以用于早期发现轻度CP,并且有助于判断CP病理的严重程度。DWI扫描ADC值在CP早期诊断方面无特殊意义,但如果CP诊断明确,ADC值可以帮助判断CP的病理严重程度。 第三部分阻塞性慢性胰腺炎模型胰腺组织块高分辨魔角旋转氢质子磁共振波谱分析 目的：利用高分辨魔角旋转核磁共振波谱分析(HR-MAS NMR)方法探索早期阻塞性慢性胰腺炎的代谢特征。 材料和方法：39头巴马小型猪随机分成实验组(n=27)和对照组(n=12)；实验组采用主胰管不全结扎法建立慢性胰腺炎模型,对照组为假手术组。在造模术后4、8、12周,每组随机抽取1/3实验动物(实验组9头,对照组4头)行相关影像学检查后处死获取胰腺组织,并行大体病理学及镜下观察(HE和VG染色),将所获取组织块分为正常胰腺组,轻、中及中度慢性胰腺炎组,并对胰腺组织块进行HR-MAS NMR分析其代谢特征,利用主成分分析法筛选特异性代谢标志物,并对各组胰腺组织的特异性代谢物特征进行比较分析。 结果：27头实验组猪中,术中及术后共有3头小猪死亡(1头为麻醉意外,另2头死于感染),剩余24头实验小猪中共有22头被病理确定形成慢性胰腺炎(剩余2头为正常胰腺),其中轻度10头,中度5头,重度7头,对照组12头小猪全部为正常胰腺。HR-MAS NMR及主成分分析结果表明在慢性胰腺炎病程中,胆碱、甘氨酸、甜菜碱、乳酸、脂肪酸、磷酸胆碱／甘油磷酸胆碱8种代谢物为特征性的代谢产物。随着炎症进展,甘氨酸、甜菜碱、磷酸胆碱／甘油磷酸胆碱、亮氨酸／异亮氨酸／结氨酸水平整体趋势是逐渐下降的,但正常组与轻度组、中度组与重度组间无统计学差异,其他各组间均有显著统计学差异(P0.01)；乳酸水平整体趋势逐渐升高,但正常组与轻度慢性胰腺炎组、中度组与重度组间无统计学差异,其他各组间均有显著统计学差异(P0.01)；胆碱、牛磺酸水平在轻度时一过性升高,但在中重度时又下降,但轻度CP组胆碱水平与其他各组水平均有显著统计学差异(P0.01),而各组间牛磺酸水平均无统计学差异；四组中轻度组的脂肪酸水平最低,且与重度组脂肪酸水平有显著统计学差异(P0.05),其他各组间均无显著统计学差异。 结论：早期慢性胰腺炎主要是炎症反应对胰腺组织细胞的破坏,胰腺自身代谢处于代偿期,胆碱可能作为早期诊断慢性胰腺炎的生化标志物；随着炎症进展,胰腺代谢逐渐失代偿,相关代谢标志物(胆碱,甜菜碱、磷酸胆碱／甘油磷酸胆碱、亮氨酸／异亮氨酸／结氨酸、甘氨酸和乳酸)呈现趋势性改变,并与病理改变有良好相关性。 第四部分小型猪慢性胰腺炎模型的血清及尿液代谢组学研究 目的：对不同程度慢性胰腺炎(CP)小猪的血清及尿液,采用超高效液相色谱(UHPLC)与四极杆-飞行时间串联质谱(Q-TOF/MS)联用技术进行代谢组学分析,初步筛选正常及各期CP小猪血清及尿液的代谢组学特征,寻找能够有助于CP早期诊断的可能生化标志物。 材料和方法：采用主胰管大部结扎法制作小型猪慢性胰腺炎模型39头,对照组为12头小型猪假手术组,并在造模术后4、8、12周,每组随机抽取1/3实验动物(实验组9头,对照组4头)行相关影像学检查后处死获取胰腺组织及血液尿液标本,最后经胰腺病理结果分为对照组、轻度CP组及中重度CP组,血清及尿液标本经过预处理后,行超高效液相色谱(UHPLC)与四极杆-飞行时间串联质谱(Q-TOF/MS)联用技术进行代谢组学分析,分析后获得总离子色谱(total ion chromatography, TIC)。对获得数据进行整合并进行多元统计分析(multivariate analysis,MVA),包括偏最小二乘法-判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA),正交信号校正偏最小二乘法分析(orthogonal single collection partial least squares,OPLS)后分别获得得分图(scores plot)和负载图(loading plot)以及可能的生化标志物。 结果：基于UHPLC-TOF-MS谱图信息,使用PLS-DA模型对三组血清样本分析表明,对照组、轻度CP组及中重度CP组均有较明显的分离趋势,通过OPLS发现三组间可能相关的生化标志物,结果发现逐渐上调的标志物有3种,逐渐下调的有2种,轻度CP组下调而中重度CP组上调的有5种；尿液样本分析结果表明对照组与各期CP组均有显著差异,而轻度CP组与中重度CP组间无显著统计学差异,对照组与轻度CP组相比较,正负模式下共发现22种模型组标志物,其中6种上调,16种下调。上述代谢标志物均通过与代谢小分子数据库(http://metlin.scripps.edu)确认。 结论：应用基于UHPLC-TOF-MS的代谢组学方法可了解CP模型猪的尿液及血清代谢变化规律,采用相关代谢标志物及其变化规律有助于CP的早期诊断。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R576;R445.2
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本文编号：
2261411
