基于Survivin靶胰腺癌MRI成像的实验研究

发布时间：2020-05-19 07:42

【摘要】：第一部分 胰腺癌Survivin基因的MR分子探针的构建 目的：合成壳聚糖修饰的磁性纳米颗粒以及靶向胰腺癌Survivin基因的MR分子探针。并对该纳米颗粒和MR分子探针的性质进行表征。 材料与方法：1、共沉淀法制备γ-Fe2O3纳米颗粒：在N2的保护下将氨水逐渐滴入200mL PH值1.7的FeC13·6H2O (0.01M)和FeSO4·7H2O (0.006M)的混合溶液中,同时剧烈的搅拌溶液,直到混合液的PH值上升到9时,得到黑色的沉淀物。使用磁分离法洗涤4-5次即得到Fe304纳米颗粒。用0.1M的HCl调节溶液PH值至3.0,在95-100℃鼓入空气,搅拌1h左右直至溶液变成棕红色即得到γ-Fe203。其次使用壳聚糖(Chitosan, CS)对γ-Fe2O3纳米颗粒表面进行修饰(修饰后的纳米颗粒表示为CS@MNPs):将0.03g壳聚糖粉末溶解于3m11%的醋酸溶液中,加入到20mL、3.8mg/mL的γ-Fe2O3溶液中,室温充分搅拌4h后磁分离法水洗3-4次,洗去游离的CS,最终将得到的纳米颗粒CS@MNPs分散在水中,超声充分分散后用0.1M的HCl调节PH值至5,溶液于4℃保存备用。 2、MR分子靶向探针的制备：(1)将3.5光密度值(Optical density,OD) Survivin反义寡聚脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, ASODN)在偶联剂EDC/NHS (1-ethyl-3-(3-dimethyl-amino-propyl)-1-carbo-DiImidehydrochloride/N-hydroxysuc-cinimide)溶液中25℃活化20min,然后以加入不同剂量CS@MNPs继续以25℃震荡2h。混合液用磁分离法洗涤2-3次,将所制得的探针Sur-MNPs (Survivinmagnetic molecular probe,Sur-MNPs)分散于水溶液中,调节PH值至5.0。(2)采用琼脂糖凝胶电泳分析靶向探针的偶联效果；采用透射电镜(Transmission electron microscopy,TEM)观察CS@MNPs和探针的形态及核心粒径；通过傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)分析CS@MNPs的表面基团。使用振动样品磁强计(Vibrating sample magnetometer, VSM)、磁共振等测量CS@MNPs和探针的磁学性质。 结果：反义寡聚核苷酸成功地被连接到CS@MNPs表面得到靶向胰腺癌Survivin基因的靶向探针。CS@MNPs的红外光谱图上出现了壳聚糖的氨基峰说明了壳聚糖已经包被到了γ-Fe2O3的表面。透射电镜结果显示靶向探针纳米颗粒的核心粒径在12nnm左右,分散均匀。CS@MNPs的弛豫率为68.25mM-1×S-1接近文献记载的磁性样品的值,适合作为MR成像的对比剂。琼脂糖凝胶电泳结果显示MR探针所在泳道出现了位置与单纯Survivin ASODN一样的条带,说明了纳米颗粒表面连接了ASODN。通过化学交联法制备出的MR探针具有稳定性和分散性好、颗粒均匀、磁学性质良好的优点。 结论：本实验中研制出的MR分子靶向探针Sur-MNPs粒径小、磁学参数理想,具备了作为MR对比剂的条件,为进一步的分子探针的体内外实验奠定了基础。 第二部分 Survivin基因MR分子探针体外转染胰腺癌BxPC-3细胞系 目的：通过CS@MNPs、Sut-MNPs与胰腺癌细胞共同孵育的方法评价探针对癌细胞的转染效果以及分析修饰后的颗粒CS@MNPs的细胞毒性。研究分析制备的靶向探针体外成像的能力 材料与方法：将γ-Fe2O3、CS@MNPs、Sur-MNPs三种不同的纳米颗粒分别与胰腺癌细胞BxPC-3共同孵育24h后,(1)通过普鲁士蓝染色定性观察细胞对这三种纳米颗粒的吞噬情况；(2)采用二甲基四氮唑法(Microculture tetrazolium assay, MTT)测CS@MMNPs、γ-Fe2O3对细胞活力的影响,设置人肺成纤维细胞WI-38细胞作为对照组；(3)通过透射电镜(TEM)分析纳米颗粒在细胞的分布：将孵育后的三组细胞(调节细胞数约lxl05个)加入1ml浓盐酸水浴60℃裂解细胞使细胞内的铁纳米颗粒充分溶解为铁离子,然后用邻二氮菲法测定铁浓度,计算单个细胞吞噬的铁含量。另收集细胞悬液,用2.5%戊二醛溶液40℃固定1h,室温下1%四氧化锇溶液固定1h, PBS清洗2-3次,每次5min,梯度乙醇脱水,环氧树脂包埋,常规制作超薄切片,转移到铜网,透镜观察颗粒在细胞内的分布情况。(4)分别收集三组标记的细胞,用1ml1%琼脂糖溶液将细胞重悬于Eppendorf管中,轻微吹打分散细胞,待琼脂糖冷却凝固后,置于1.5T MR上行横断位扫描,另设纯净水、未孵育任何纳米材料的空白细胞作为对照组。MR扫描参数为：T2WI SE序列重复时间(Revetition time, TR):2500ms,回波时间(Time of echo,TE):22ms,16个回波,翻转角30。,视野250mm,层厚5mm,矩阵256×128。勾画感兴趣区(ROI)0.32cm2,分别测定各管T2值。 结果：普鲁士蓝染色显示孵育CS@MNPs和MR探针的胰腺癌细胞内有大量的蓝色铁颗粒分布,而孵育γ-Fe2O3的癌细胞组内仅散在少许细胞内见到蓝色颗粒,说明靶向探针和修饰后的纳米颗粒能够有效的转染胰腺癌细胞。MTT结果可见修饰后的纳米颗粒CS@MNPs对细胞的毒性明显低于未经修饰的γ-Fe2O3组。TEM结果显示纳米颗粒分布在细胞质内,几乎未能进入细胞核。各组铁含量中探针组最高18.24±0.79pg;γ-Fe2O3组最低9.32±0.21pg。磁共振结果显示转染磁性纳米后的细胞能降低T2WI的信号,其中以转染靶向探针的细胞组最为明显,各组T2值分别为：空白细胞组331.5±18.3ms,γ-Fe2O3组219.5±21.8ms, CS@MNPs组218.0士17.3ms,探针组171.7±32.5ms。 结论：经壳聚糖修饰后的纳米颗粒能够有效降低细胞毒性作用,显著提高了转染效率,因此选用其作为MR分子探针的载体能高效的转染胰腺癌BXPC-3细胞,并能在较低浓度引起MR T2WI信号的下降。透射电镜结果显示本实验制备的探针是能够穿过细胞膜进入细胞内。因此,本实验制备的探针Sur-MNPs是一个良好的特异性靶向胰腺癌的MR分子探针。 第三部分 MR靶向探针应用于裸鼠胰腺癌模型的活体MR成像研究目的：1、建立原位人胰腺癌裸鼠模型；2、研究靶向探针Sur-MNPs对胰腺癌裸鼠模型的MR分子成像,结合MR图像和病理结果分析靶向探针的MR成像效果及体内分布情况。 材料与方法：1、培养转染绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的人胰腺癌BxPC-3细胞株(BxPC-3-GFP)待细胞贴壁生长状态良好时,胰酶消化、离心,将细胞悬液分别注射于15只裸鼠的腹部皮下。待皮下肿瘤成形后取部分肿瘤组织,手术缝合至裸鼠胰腺内,于荧光成像仪下动态监测肿瘤生长情况,待肿瘤生长到lcm左右时行MR分子成像实验。2、MR扫描参数：常规T1WI:TR650ms, TE29ms,层厚1mm,层距为0.1mm; T2WI冠状位及轴位：TR/TE为7400ms/71ms;层厚1mm,层距为0.1mm；T2WI快速自旋回波序列(Fast spin echo,FSE):TR/TE为1850ms/14.9ms,激励次数12；层厚lmm,层距为O.1mm。先对荷瘤鼠行MR平扫,再经尾静脉注入200u1的0.5mg/ml靶向探针,分别在注射探针后30min、12h、24h、40h各时间点做MR增强扫描,于各时间点分别处死3只裸鼠。对照组设3只裸鼠注射非靶向探针CS@MNPs。扫描结束后,取小鼠的肝、脾、肾、胰腺、肿瘤组织进行HE、普鲁士蓝染色等病理检测。3、对比MRI图像和组织的普鲁士蓝染色结果,评价胰腺癌靶向探针的靶向成像效果。对所得图像肿瘤部位画出感兴趣区(Read of interest,ROI)测量T2值,采用单因素方差分析(One-factor analysis of variance, ANOVA)于SPSS18.0统计软件上比较分析平扫、增强后24h、40h之间的信号差异,p0.05认为结果有统计学意义。 结果：注射探针24h后普鲁士蓝染色显示肿瘤组织周边有较多的蓝色铁颗粒分布,MR T2WI上可见肿瘤组织信号的有着轻度的降低(T2值70.4±7.4ms,平扫为84.3±6.1ms)；42h时肿瘤的中心部位开始见到蓝色的铁颗粒(T2值56.9±2.3ms),说明靶向探针能够穿越肝脾网状内皮系统的吞噬到达肿瘤组织T2WI信号有着轻度的降低,但组织的病理普鲁士蓝染色显示靶向探针已经较多的分布在肿瘤组织内。统计学分析F=20.812,p=0.000,24h与40h之间的信号差异有统计学意义(p=0.003) 结论：MR分子探针能有效的分布到裸鼠的胰腺原位肿瘤,引起瘤体MRT2信号的降低,其普鲁士蓝染色结果也证实该探针能分布在胰腺癌组织中,表明Sur-MNPs是一个理想的胰腺癌MR靶向分子探针,但是应用于临床仍需要解决如何放大信号等问题。
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2.3. 流式细胞术检测细胞m跬鍪笛橥，

本文编号：2670563