携IL-8单抗靶向超声造影剂的制备及体外与血管内皮细胞作用实验研究

发布时间：2020-05-20 00:14

【摘要】：目的：制备IL-8单克隆抗体与声诺维(SonoVue)微泡偶联的声学造影剂,并探讨其偶联的方法学。在此基础上,通过携IL-8单抗靶向超声造影剂分别与正常内皮细胞和损伤内皮细胞相互作用,体外评价该造影剂的靶向粘附效能,并探讨IL-8在粥样斑块形成过程中所起的作用和评价血管内皮功能的新方法,为临床早期诊断和治疗动脉粥样硬化提供新的影像学依据奠定基础。 方法：1.采用SPDP交联法将IL-8单克隆抗体与SonoVue微泡偶联：IL-8单克隆抗体溶于PBS缓冲溶液中,加入SPDP溶液反应,离心、洗涤后得到带毗啶二硫基的单克隆抗体；加入过量的二硫苏糖醇(DTT)醋酸溶液,再反应、离心、洗涤,得到带巯基的抗体溶液。取SonoVue悬液加入SPDP溶液,洗涤后与带巯基的抗体溶液混合反应,最终得到与IL-8单克隆抗体偶联的声学微泡悬液。 2.IL-8单克隆抗体偶联声学微泡的鉴定：(1)玻片凝集实验：在洁净载玻片上,均分别与羊抗鼠IgG血清、生理盐水混合,数分钟后置于一普通显微镜下观察微泡状态。(2)免疫荧光染色实验：IL-8单抗偶联SonoVue微泡、未偶联SonoVue微泡悬液均分别与羊抗鼠IgG-FITC混合反应,荧光显微镜下观察荧光染色的效果。 3.采用含15%胎牛血清的人RPMI1640培养基将人脐静脉内皮细胞培养至业融合状态,经0.25%胰酶消化后,取一部分细胞加入PBS缓冲溶液,建立正常内皮细胞组；取另一部分细胞加入TNF-α干预,建立损伤内皮细胞组。两组细胞继续培养24h后,行免疫细胞化学染色检测细胞表面IL-8的表达水平。 4.倒置显微镜下观察未偶联SonoVue微泡、靶向性微泡分别与正常内皮细胞、损伤内皮细胞的结合作用,高倍视野下计数内皮细胞及粘附的微泡数目,通过计算微泡与内皮细胞的比值对两者之间的结合作用进行定量分析。 结果：1.未偶联的SonoVue微泡大小较均一(直径2-4μm),分布较均匀,呈单个、散在分布；IL-8单克隆抗体偶联SonoVue微泡浓度稍低于未偶联的SonoVue微泡浓度,但与未偶联微泡大小、形态、性状基本相似,无明显变化。 2.玻片凝集实验中,IL-8单克隆抗体偶联SonoVue微泡悬液与二抗(羊抗鼠IgG血清)混合液,普通显微镜下可见发生明显凝集反应；未偶联SonoVue微泡悬液与二抗混合液、IL-8单克隆抗体偶联SoneVue微泡悬液与生理盐水混合液及未偶联SonoVue微泡悬液与生理盐水混合液,普通显微镜下微泡均未发生明显凝集反应。免疫荧光染色实验中,仅IL-8单抗偶联SonoVue微泡表面可见明显绿色荧光,而未偶联SonoVue微泡未见荧光。 3.免疫细胞化学染色显示正常血管内皮细胞的细胞核呈蓝紫色,而细胞表面几乎未见着色；经TNF-a诱导后,损伤组血管内皮细胞的细胞核同样呈蓝紫色,但是细胞表面几乎着棕色。 4.倒置显微镜下未偶联微泡、携IL-8单抗微泡分别与正常内皮细胞、损伤内皮细胞粘附作用的定量分析显示与正常内皮细胞的粘附作用在两组微泡之间均无明显差异；而携IL-8单抗靶向微泡与损伤内皮细胞的粘附作用明显高于未偶联微泡(P0.01),未偶联SonoVue微泡与损伤内皮细胞的粘附作用稍高于与正常内皮细胞的作用,但是差异无统计学意义：携IL-8单抗靶向微泡与损伤内皮细胞的粘附作用明显高于正常内皮细胞(P0.01)。 结论：1.玻片凝集实验可见IL-8单克隆抗体偶联的声学微泡混悬液与二抗混合反应后发生了明显的凝集反应,免疫荧光染色实验可见IL-8单克隆抗体偶联声学微泡表面发出明显绿色荧光,均说明IL-8单克隆抗体已成功偶联到微泡外壳表面,即该靶向性造影剂的制备时成功的。 2.经过SPDP交联后,虽然制备的靶向微泡浓度有所减低,但是该微泡的大小、形态、性状没有显著改变,说明SPDP与抗体偶联后的声学造影剂其物理、生物性状是没有改变的,仍可以作为造影剂作用于生物体内。 3正常内皮细胞经TNF-α干预受损后,损伤内皮细胞免疫细胞化学染色显示细胞核呈蓝紫色,而细胞表面呈棕色,说明损伤内皮细胞表面存在IL-8,证实TNF-α诱导内皮细胞分泌IL-8成功。 4.免疫细胞化学染色证实TNF-α诱导后,损伤内皮细胞分泌IL-8呈高表达,可见选择IL-8单克隆抗体作为靶向抗体偶联到SonoVue微泡表面,可以更为准确的检测损伤内皮细胞提供了新的方法。 5.体外细胞实验可见大量携IL-8单克隆抗体靶向微泡粘附于损伤细胞表面,表明IL-8单克隆抗体偶联到微泡表面后仍具有免疫活性。 6.体外细胞实验虽然可见数个未偶联SonoVue微泡粘附于损伤细胞表面,但是显著低于携IL-8单克隆抗体靶向微泡的结合作用,说明采用SPDP交联法制备的携IL-8单抗靶向微泡与靶细胞结合的作用是高效的和特异的。 7.体外细胞实验通过携IL-8单克隆抗体靶向微泡利用与损伤内皮细胞表面特异性抗原-抗体反应,大大提高了与损伤内皮细胞的粘附作用,为今后应用靶向性超声造影技术检测内皮损伤、评价内皮功能奠定了基础。
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R445.1

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本文编号：2671702