碳离子辐照引起的线粒体DNA损伤突变及相关方法学研究

发布时间：2020-07-01 17:16

【摘要】：目的：确定碳离子辐照引起的线粒体DNA损伤和突变情况；探讨利用硅碳量子点标记线粒体的可能性；初步研究线粒体活性氧激发剂的生物学效应。 材料和方法：采用12C6+离子束或X射线对肿瘤细胞进行辐照，荧光定量PCR进行线粒体DNA5464-7287编码区损伤和4977大片段缺失定量检测；辐照后克隆存活检测；直接测序法检测D310区点突变。细胞MTT实验检测硅碳量子点（SiCDs）的细胞毒性，酶标仪检测硅碳量子点处理后细胞和斑马鱼体内SOD、MDA和ROS的含量，激光共聚焦确定其染色部位。MTT实验和酶标仪检测光诱导型线粒体活性氧激发剂Mitochondros的发光特性及细胞毒性。 结果：线粒体DNA5464-7287编码区对0.5-2Gy碳离子辐射有很高的敏感性，预先半小时加入维生素C后的样本线粒体DNA损伤明显减少。以10%存活分数（D10）作为标准，碳离子对MCF-7细胞的相对生物学效应为3.1（1.5Gy碳离子/4.65Gy X射线）。D310区SNP位点克隆突变检测发现碳离子辐照后存活的MCF-7细胞中正常C7序列比X射线辐照后明显减少（58%vs.74%），单碱基插入C8和单碱基缺失C6的丰度则明显升高，分别是18%和24%。碳离子和X射线辐照后MCF-7细胞中线粒体DNA4977缺失的变化趋势在72小时内表现一致，照后24小时达到峰值，并在随后的48小时和72小时时间点迅速下降至本底水平。射线类型对线粒体DNA4977缺失的产生无明显区别。生物相容性检测显示低浓度SiCDs对24h细胞和斑马鱼存活无影响，其染色后细胞和斑马鱼的SOD及MDA含量降低。SiCDs的染色性质测定表明SiCDs在活细胞及活体成像中荧光信号强，耐光性好，且在405、488和555nm均可检测到荧光信号，SiCDs对HepG2的染色没有进入细胞核,只有胞质区表现出荧光。中低浓度的线粒体活性氧激发剂Mitochondros培养24h对HepG2细胞存活无影响，其激发和发射波长在428nm和600nm，培养24h后细胞中Mitochondros的荧光检测发现除最低浓度0.1ng/ml外，其他浓度的Mitochondros荧光强度与0.1ug/ml的最高荧光强度值无明显区别。 结论：碳离子辐照会引起严重的线粒体DNA5464-7287编码区损伤，损伤主要来源于氧化胁迫。碳离子对MCF-7细胞的杀伤作用明显强于X射线，且其对于D310区的致突变能力显著高于X射线辐照。线粒体DNA4977bp缺失的存在对宿主细胞能够产生严重的氧化胁迫，在大多数情况下不能在存活细胞中得到遗传，且碳离子与X射线所引起的线粒体DNA大片段缺失突变没有本质区别。低浓度SiCDs对细胞和斑马鱼没有毒性，荧光信号强，耐光性好，适合作为生物学荧光标识物，其线粒体靶向性有待提高。中低浓度线粒体活性氧激发剂Mitochondros培养24h对细胞没有毒性，线粒体内能容纳的Mitochondros的量是一定的，初步说明其适合作为细胞中的活性氧激发剂。结合之前的MTT实验，最高荧光强度值的浓度0.1ug/ml可以作为后续实验的标准浓度。
【学位授予单位】：中国科学院研究生院（近代物理研究所）
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：Q691;R730.55
【图文】：

量碳重离子或 X 射线处理后 MCF-7 细胞的存活曲线 D310 区点突变检测SNP 位点克隆突变检测发现 X 射线能够在存活细胞中引变，重离子射线辐照后存活的 MCF-7 细胞中正常 C7 序），单碱基插入C8和单碱基缺失C6的丰度则明显升高， 2.1。这表明重离子射线辐照在 MCF-7 细胞中能够引起严1 在两组处理条件下存活细胞克隆中 D310 多态性分布情D310 C-track Sham-irradiated X-ray Carbon ionsC6 8% 16% 24%C6/C7 4% 0 0C7 74% 70% 58%C8 12% 14% 18%C7/C8 2% 0 0

MCF-7细胞经1.5 Gy 碳重离子或4.65 Gy X射线辐照后72小时以内线977缺失含量变化情况论6+离子束辐照可以引起线粒体 DNA5464-7287 区的损伤。线粒体既是氧的主要来源又是活性氧攻击的主要靶点，维生素 C 作为一种被广泛化剂，对辐照导致的线粒体 DNA 损伤有显著的保护作用。维生素 C 给电子而转变成脱氢抗坏血酸，以清除·OH、DPPH·等自由基。低剂射后细胞内线粒体 DNA 损伤的主要来源是自由基，此时，只有有效来源活性氧才能线粒体 DNA 损伤。极低剂量（0.5Gy）重离子辐照时 数量增加可能由于线粒体 DNA 是环状结构，极低剂量辐照仅仅破坏初的完整结构使其变为线性，从而提高了扩增效率，导致线粒

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本文编号：2737056