人心肌肌钙蛋白I的几种检测方法及其应用研究

发布时间：2020-07-13 22:30

【摘要】：心肌肌钙蛋白I(cTnI)是组成心肌肌钙蛋白复合物的亚单位之一，具有高度的心肌特异性，被认为是诊断心肌损伤的“金标准”。快速、灵敏、准确测定人血中的cTnI对于诊断急性心肌梗死、急性冠状动脉综合征的危险分层、监测各种因素所导致的心肌损伤、以及心脏事件的判断预后等有着重要的意义。目前，测定cTnI的方法主要有放射性同位素免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附试验法(ELISA)、化学发光免疫分析法(CLIA)、荧光免疫分析法(FIA)、以及金标免疫分析法等。其中，RIA法因有放射性污染的危险已基本不使用；CLIA法和FIA法灵敏度较高，但仪器价格偏高，国内在这方面的研究相对较少；金标免疫分析法主要应用于制作定性分析用的免疫层析试纸条，现在国内各医院多使用国外公司的产品，价格昂贵，国内学者虽在这方面有不少研究，但其灵敏度不高，难以推向市场；目前国内研究和应用最多的方法是ELISA，该方法灵敏度适中，使用相对简便，仪器价格也不很高，但存在测定周期偏长、灵敏度相对较低、检测范围较窄等不足。考虑到检测人血液中cTnI对于判断心肌损伤的重要性，以及目前国内测定cTnI的方法所存在的这样或那样的缺陷，本论文从快速、灵敏、准确测定和降低检测成本等方面入手，综合应用纳米金标记技术、纳米孔材料上的生物分子固定化技术、以及高灵敏的电化学检测技术和化学发光检测技术，建立了几种测定人cTnI的方法，弥补了现有方法的某些不足。具体内容如下： 1．金标银染法快速检测人血清中cTnI的研究纳米金具有特殊的光学和电学性质，生物相容性好，是继放射性同位素、酶、发光(荧光)物质之后的又一种卓越的免疫标记物质，银染技术的引进使其可见性得以显著提高，从而使免疫检测的灵敏度随之大幅度提高。本文以硝酸纤维膜作为基底，结合一步法双单克隆抗体夹心技术、低密度蛋白芯片技术、纳米金探针技术、以及纳米金颗粒上的银染放大技术建立了一种检测人心肌肌钙蛋白I的快速测定法。方法具有极高的特异性，当血清样品中心肌肌钙蛋白T(cTnT)、肌红蛋白(Mb)、以及骨骼肌肌钙蛋白I(sTnI)的浓度分别高达0.2 μg／mL、100 μg／mL、以及30 μg／mL时，仍然不干扰cTnI的测定和判断；检测速度快，能在40分钟内报告测定结果；耗样量少，一次测定只需要10 μL血清样本；方法重复性好，同一样品在同一块基片上的测定结果的批内变异系数(n=8)以及不同时间在不同基片上的测定结果的批间变异系数(n=8)均小于20％；通过对200例正常人血清标本的测定获得了该方法的临界值(CUT-OFF)为0.3 ng／mL，以此临界值作为判断依据测定了588例病人血清中的cTnI含量，同时与ELISA法的测定结果进行比较(采用SPSS 11.0统计分析软件)，显示两种方法的测定结果间差异不具有显著性意义(P=0.66；一般认为当P＞0.05时，两种方法之间的差异不具有显著性意义)，由两种方法判断所得结果的符合率为86％。 2．测定人cTnI的阳极溶出伏安法研究介孔分子筛具有比表面积大、孔径与生物分子尺寸相当、表面基团丰富并易功能化和孔道结构规则有序等独特的优点，是制作化学修饰电极、固定生物活性分子的理想材料。本文首次以分子筛作为修饰剂制备碳糊修饰电极用于固定抗体分子，并以该修饰电极结合抗原抗体的双抗体夹心反应、纳米金标记抗体技术、纳米金上的银增强技术、以及阳极溶出伏安法等方法和技术，建立了一种测定人血清中cTnI的电化学免疫分析新方法，并进行了其应用的可行性分析。实验表明，在分子筛修饰制备的修饰电极上相对于纯碳糊电极上阳极溶出峰电流信号有显著增强，在SBA-15(孔径9.19 nm)修饰碳糊电极(SBA-MCPE)、MCM-41(孔径3.10 nm)修饰碳糊电极(MCM-MCPE)、Y型分子筛(孔径0.74 nm)修饰碳糊电极(Y-MCPE)、以及未经修饰处理的纯碳糊电极(CPE)上的峰电流比值约为10∶7∶2∶1，显示分子筛对抗体分子的固定能力与分子筛的孔径正相关；采用单因素变化法优化了实验条件，银的阳极溶出峰电流信号与血清中cTnI的浓度在0.5～5.0 ng／mL的范围内呈良好的线性关系，线性回归方程为：Ip(μA)=1.0 +3.5 C(ng／mL)，相关系数R~2=0.98，方法检出限为0.2 ng／mL：对实际样品的测定结果与ELISA法的测定结果基本吻合。 3．化学发光酶免疫分析法检测人血清中cTnI的研究化学发光免疫分析法(CLIA)是一种高灵敏度的免疫分析法，其检测灵敏度可与RIA法相媲美。本文在传统的ELISA法的基础上，在进行免疫反应后，改用高效的化学发光试剂3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基4-(3”-羟基)苯-1，2-二氧杂环丁烷磷酸(AMPPD)作为检测底物，并且将传统的两步双抗夹心法改为一步法进行免疫反应，建立了一种高灵敏度的测定人血清中cTnI的化学发光酶免疫分析法。采用单因素变化法和方阵滴定法得到的最佳实验条件为：捕获抗体包被浓度选择10 μg／mL，选择pH 7.0的PBS作为免疫反应缓冲底液，以含1％ BSA的pH 9.6碳酸盐缓冲液4℃封闭过夜，生物素-检测抗体(Biotin-IgG_2)以及碱性磷酸酶-亲和素(ALP-Avidin)结合物的稀释度均采用1∶2000，免疫反应条件为37℃孵育60 min，以去离子水作为洗涤剂，以1∶100稀释的AMPPD作为发光反应底物，选择发光反应时间为10 min(37℃)。方法充分发挥了化学发光法的高灵敏度检测优势，具有很高的灵敏度，检出限为0.02 ng／mL，比传统的ELISA法检测限降低一个数量级以上；检测速度较快，整个测定周期约75 min，比传统的两步法ELISA快得多；检测范围宽(0.04～36.2 ng／mL)，比传统ELISA法扩宽了近两个数量级；方法准确可靠，加标试验回收率介于97.5％～102.8％之间，对实际样品的测定结果与ELISA法的测定结果相吻合；重复性好，三个样品的批内变异系数均小于8.5％(n=12)，批间平均变异系数小于15％(n=8)。
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R817.4;R446.6

【参考文献】