氯硝柳胺对三阴性乳腺癌细胞的放射增敏作用及其机制研究
发布时间：2020-07-15 02:38
【摘要】：乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤,目前主要采取手术结合放／化疗的综合治疗手段进行治疗,但是乳腺癌的高度异质性使得部分分子亚型尤其是三阴性乳腺癌的疗效欠佳,预后较差,是近年来乳腺癌诊治研究的难点和关注的焦点,而且辐射抵抗仍是三阴性乳腺癌放射治疗面临的重要难题。许多研究表明Wnt/β-catenin信号通路异常高表达和AKT异常活化在乳腺癌尤其是三阴性乳腺癌中广泛存在,与其辐射抵抗和预后不良密切相关,而且Wnt/β-catenin信号通路异常活化显著提高了乳腺癌细胞对辐射诱导的DNA双链断裂(DSBs)的修复能力。为此,本研究选用具有靶向抑制乳腺癌细胞Wnt/β-catenin信号通路作用的氯硝柳胺,从细胞分子水平首次证实氯硝柳胺对人三阴性乳腺癌细胞具有显著的放射增敏作用,抑制辐射诱导的Wnt/β-catenin信号通路活化和AKT激活,同时抑制辐射诱导DNA DSBs的非同源末端连接(non-homologous end joining. NHEJ)修复通路是其放射增敏的重要机制。本研究以期探寻新的针对三阴性乳腺癌的靶向放射增敏剂,并为氯硝柳胺与放疗联合应用以提高治疗三阴性乳腺癌的疗效提供实验依据。第一部分：氯硝柳胺对三阴性乳腺癌细胞的放射增敏作用与抑制Wnt/β-catenin信号通路和AKT活性的作用机制目的 研究世界卫生组织(WHO)推荐杀灭绦虫的首选药物氯硝柳胺对三阴性乳腺癌细胞的放射增敏作用及其抑制辐射诱导Wnt/β-catenin信号通路活化和AKT激活的作用机制。方法 四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同浓度氯硝柳胺对三阴性乳腺癌MDA-MB-231和Hs578T细胞及非三阴性乳腺癌T-47D和MCF-7细胞生长的抑制作用,以及不同浓度的LiCl对MDA-MB-231细胞生长的抑制作用,求得IC50值。将细胞分为空白对照组、氯硝柳胺或LiCl单纯给药组、单纯照射组、氯硝柳胺+照射组或LiCl联合氯硝柳胺+照射组,氯硝柳胺和LiCl预处理各种细胞的的浓度均为低于各自20%IC50,克隆形成试验检测氯硝柳胺和LiCl联合氯硝柳胺作用对乳腺癌细胞放射敏感性的影响,137Cs y射线的照射剂量为0、2、4和6 Gy;免疫荧光法检测辐射诱导的MDA-MB-231细胞P-catenin核内定位情况；Western blot法检测p-β-catenin和β-catenin、p-AKT和AKT、Cyclin D1以及cleaved-caspase-3、 caspase-3、Bax、Bcl-2和LC-3β蛋白的表达;流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡的变化。结果MDA-MB-231、Hs578T、T-47D和MCF-7细胞的SF6值分别为0.17±0.05、0.12±0.02、0.06±0.01和0.03±0.01,表明三阴性乳腺癌细胞较非三阴性乳腺癌细胞具有更强的辐射抗性。氯硝柳胺抑制MDA-MB-231、Hs578T、T-47D和MCF-7细胞生长24 h的ICso值分别为13.63±0.43、25.32±0.54、3.87±0.11和3.68±0.13μM,LiCl抑制MDA-MB-231生长24 h的IC50值为154.11±2.86mM。1.0和1.5μM氯硝柳胺预处理MDA-MB-231细胞后的SER值分别为1.40±0.06和1.63±0.07,1.0和1.2州氯硝柳胺预处理Hs578T细胞后的SER值分别为1.54±0.06和1.63±0.06,0.4和0.8μM氯硝柳胺预处理T-47D、MCF-7细胞后的SER值分别为0.96±0.04、0.99±0.03、1.12±0.06和1.18±0.10。10mM LiCl和1.5μM氯硝柳胺联合预处理MDA-MB-231细胞后的SER值为1.24±0.09。氯硝柳胺预处理显著抑制了辐射诱导的MDA-MB-231和Hs578T细胞代表入核的p-β-catenin (S675)、β-catenin、Cyclin D1、p-AKT (S473)和p-AKT (T308)蛋白表达的升高,并明显降低辐射诱导的MDA-MB-231细胞β-catenin在核内的积聚(P0.05),显著提高辐射诱导的cleaved-caspase-3和LC-3p蛋白表达,致使辐射诱导G2/M期阻滞明显减少(P0.05)、细胞凋亡显著增加(P0.05)。LiCl消除了氯硝柳胺下调MDA-MB-231细胞p-β-catenin(S675)、β-catenin及Cyclin D1表达的作用,从而消除了氯硝柳胺引起的G0/G1期阻滞。结论氯硝柳胺对三阴性乳腺癌MDA-MB-231和Hs578T细胞具有显著的放射增敏作用,而对雌、孕激素受体阳性的T-47D和MCF-7细胞的放射敏感性无明显影响,提示氯硝柳胺的放射增敏作用可能对三阴性乳腺癌细胞具有特异性。其作用机制与抑制Wnt/β-catenin信号通路和AKT活性,减少辐射诱导的G2/M期阻滞,显著增加caspase介导的细胞凋亡以及促进细胞自噬有关。Wnt/p-catenin信号通路可能是放射增敏三阴性乳腺癌的重要通路。第二部分：氯硝柳胺对三阴性乳腺癌细胞的放射增敏作用与抑制DNA双链断裂修复的作用机制目的探讨氯硝柳胺对MDA-MB-231细胞的放射增敏作用与DSBs修复能力之间的关系。方法将细胞分为空白对照组、氯硝柳胺单纯给药组、单纯照射组和氯硝柳胺+照射组,氯硝柳胺预处理的浓度为1.5μM,137Csγ射线的照射剂量为6 Gy;免疫荧光法检测辐射诱导的γH2AX、p-DNA-PKcs(T2609)、Rad51 foci形成,Western blotting法检测53BP1蛋白表达水平。结果 1.5μM氯硝柳胺预处理使辐射诱导MDA-MB-231细胞的γH2AX foci产额较单纯照射组显著增加(P0.05),并且能够显著抑制辐射引起的53BP1蛋白表达水平的上调(P0.01)和p-DNA-PKcs(T2609) foci升高(P0.05),对Rad51foci形成无显著影响。结论氯硝柳胺能够显著提高辐射诱导MDA-MB-231细胞的DNA DSBs产额、抑制非同源末端连接修复通路而发挥其放射增敏作用,而对同源重组修复通路无明显影响。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.9;R730.55
【图文】：
图１邋Ｗｎｔ／ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ经典途径\″义媳砻鳎祝睿簦ǎ常悖幔簦澹睿硇藕磐凡唤錾婕暗较窒俜⒂母鞲鼋锥危倍疾斡肓巳橄侔┑姆⑸头⒄构蹋⒃谌橄侔┑脑ず笾蟹⒓易寮捌涞鞍自谌橄俜⒂牟煌逼诔氏侄泶锏谋浠拔腋潞屠┰觯郏保担荩壳胺⑾衷趕僦兄辽儆校吨郑祝睿艋虮戆┗颍祝睿簦焓牵保梗福材暄芯咳嗽痹谛∈笕橄儆柿鲋惺状畏
本文编号：2755851
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.9;R730.55
【图文】：
图１邋Ｗｎｔ／ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ经典途径\″义媳砻鳎祝睿簦ǎ常悖幔簦澹睿硇藕磐凡唤錾婕暗较窒俜⒂母鞲鼋锥危倍疾斡肓巳橄侔┑姆⑸头⒄构蹋⒃谌橄侔┑脑ず笾蟹⒓易寮捌涞鞍自谌橄俜⒂牟煌逼诔氏侄泶锏谋浠拔腋潞屠┰觯郏保担荩壳胺⑾衷趕僦兄辽儆校吨郑祝睿艋虮戆┗颍祝睿簦焓牵保梗福材暄芯咳嗽痹谛∈笕橄儆柿鲋惺状畏
本文编号：2755851
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/fangshe/2755851.html
