放射性Annexin V的细胞凋亡显像剂研究

发布时间：2020-07-15 04:37

【摘要】：细胞凋亡是生物体一种调节细胞群体相对恒定的重要方式，近年已成为生命科学中一个非常热门的研究热点。细胞凋亡早期的特征是磷脂酰丝氨酸基团(PS)的外翻，能与PS高度特异性结合的Annexin V成为了研究早期细胞凋亡的重要标识物。近年在分子核医学显像研究中，用放射性核素标记Annexin V的凋亡显像剂研究也取得了很大的进步，这对提高对疾病的认识、评价指导疾病的治疗以及新药的开发等都具有重要的意义。本论文研究的主要目的是在已有的文献基础上，利用国内基因工程技术制备的重组的人Annexin V进行放射性核素的标记和评价，希望制备出可用于临床细胞凋亡研究的显像剂。本论文的主要研究内容如下： 1、重组Annexin V的制备纯化研究了工程菌的诱导表达和蛋白质的纯化。建立了Annexin V工程菌诱导表达的最佳温度、时间和包涵体的操作程序，并通过离子层析纯化后得到了高纯度的Annexin V。 2、~(131/125)I-Annexin V的制备研究研究了~(131/125)I-Annexin V的标记条件和稳定性，建立了纸色层和高压液相的分析方法。采用Iodo-Gen标记法，反应10min后，~(131/125)I-Annexin V的标记率大于80％，经PD-10纯化后，其放化纯大于95％。标记物在室温下稳定性较好。ITLC-SG薄层分析，展开体系为正丁醇/乙醇/氨水(5/1/2)，Rf：标记物=0.0-0.1，Γ=0.5-0.7，碘酸=0.7-0.9。HPLC：GF250色层柱，流动相为0.01mmol/LPBS，流速为1.0ml/min，保留时间：标记物为6.3min，游离碘为9.7min。3、~(99m)Tc-HYNIC-Annexin V的制备研究研究了双功能偶联剂的S-HYNIC的合成、偶联剂与Annexin V的连接和~(99m)Tc-HYNIC-Annexin V的标记以及纯化，建立了薄层分析和高压液相的分析方法。(1)合成的S-HYNIC经元素分析、IR、~1H-NMR、快原子质谱确证为所预期的化合物。解决了合成中关键的第三和第四步中3个难点：除去DMF、无水和去BOC问题。(2)偶联条件：1mol Annexin V(5.5mg/mL)与6mol S-HYNIC在HEPES溶液中避光反应5h，每个Annexin V连接上2个HYNIC，比文献值中国原子能科学研究院博士学位论文高一倍。首次研究了缓冲溶液对偶联的影响。(3)通过“3+1”的二元混合配体络合的方案，以Tricine作为协同试剂，氯化亚锡作为还原剂，室温反应30min 后，制备得放化纯95%的”9’”几一H翎xe一Annexinv。标记物t匕活度为26.sMBq 恤gAnnexinV，比文献值要高2倍以上。 4、生物学评价和动物实验研究了”’‘’2’I一Annexinv、”9nl介一H州le一Annexinv的体内外生物学性质和动物实验。(l)”51一Annexinv能在体外检测细胞的凋亡，与FITc一Annexinv流式细胞分析的结果能较好的吻合。首次初步建立了’2，I一Annexinv体外细胞凋亡的放射配基结合分析的基础。(2)通过细胞结合分析定量测定了Annexinv 的生物活性，Ko=8.53士3.3OnmolzL，盯一8.79士2.2Inmol/L。(3)正常小鼠体内分布表明:’2行一Annexinv主要浓聚于肝、脾、肾，在体内易脱碘:”gmTc- HYNIC一AnnexinV主要浓聚于肝、脾、肾和肺，从肾脏排泄。(4)通过sn大鼠凋亡模型的分布和显像实验:确定了环磷酞胺诱导骨髓内细胞的凋亡(主要在脾脏和股骨等脏器)的最佳时间为72h:首次确定了’3’I一Annexinv的最佳凋亡显像时间为6h，”glllTc一HYNIc一Annexinv为3h。(5)环磷酞胺诱导凋亡的动态显像结果表明，注射”gmTc一HYNIc一Annexinv后，实验组与对照组的股骨的放射性浓聚比值随时间的增加而增加，在lh后增加的速率放慢，3h达到最大。验证了3h为”gmTc一HYNIc一Allnexinv的最佳凋亡显像时间。总之，本论文是首次利用国内制备的重组人AnnexinV进行放射性核素的标记和评价，其中用’2，I一Annexinv进行体外细胞凋亡的放射配基结合分析，以及确定”’l一Annexinv和”gm几一H洲Ie一Annexinv的最佳凋亡显像时间的实验，还未见有文献报道。现有的实验结果表明:’2，I一Armexinv能在体外检测细胞的凋亡;制备的’3’‘’2，I一Annexinv和”9，，，几一H州Ie一Annexinv可以有效检测鼠类体内的细胞凋亡，特别是”gmTc一HYNIc一Annexinv将会成为临床上一种很有前景的体内细胞凋亡显像剂。
【学位授予单位】：中国原子能科学研究院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R817
【图文】：

原理图,凋亡细胞,检测方法,原理

图1一3、凋亡细胞常用检测方法的原理1.3细胞凋亡的常用检测技术研究细胞凋亡的方法与技术很多(图1一3)，人们研究出了许多种体外检测凋亡的方法，如:(l)电镜形态学观察，是确定凋亡最经典、最可靠的方法，但不能定量;(2)DNA凝胶电泳，依据“阶梯状，，(ladder)条带来确定凋亡，方法简便，但只能半定量，且灵敏性较差，要求所测标本的细胞数在10“以上;(3)酶联免疫吸附(ELlsA)测定核小体法，灵敏性高，可检测凋亡细胞数达5xl护mL一’

基本过程

AnnexinV是一种钙离子依赖性并能与膜磷脂结合的附加蛋白质，具有抗凝血用，它的分布广泛，在多种组织细胞(如心肌细胞、血管内皮、骨骼肌、肝细胞等)表达。Anne劝nV是人体内原本就存有的一种蛋白质，分子量约为36KD，最是由胎盘分离出来【’2，”】。人们从80年代开始就对Annexinv的功能和结构进了多方位的研究198，99，’00，’。’】。八刀ne对nv共由319个氨基酸残基组成，并确定了应的coNA[’02]。由于天然来源的Annexinv含量低，无法批量提供。在进行Annexinv的基因程中，因为AnnexinV蛋白5’编码区GC含量高，所以很难直接在E.coli中获得ne劝nV的高表达。为此，采用表达融合蛋白的方法，在Arme劝nV前加上一噬菌体的蛋白质MsZ聚合酶片段(大约15KD)，再在其间引入凝血酶识别序列。样表达蛋白经凝血酶消化，去除MSZ蛋白质后，经层析即可获得高纯度非融合AnnexinVI‘03]。DNA的克隆的基本过程见图2一1。

重组蛋白质,诱导表达,包涵体

(1:30℃sh;2:30oCgh;3:42oClh;4;42oCZh;5:42oC4h;6:包涵体;7:纯化后的蛋白)3.2包涵体和蛋白质的纯化包涵体经过提取洗涤以及凝血酶切后，通过SDS.PAGE分析(见图2一3中6)含有大量的AnnexinV。重组蛋白质Anne劝nV经过层析纯化后得到约4OmL的蛋白溶液。通过SDS一PAGE分析(见图2一3中7)得到高纯度的重组蛋白质AnnexinVOAnne五nV的分子量与文献值一致[59，69]。3.3蛋白质的含量测定BCA的标准曲线见图2并，拟合后的标准曲线为Y=习.06476+0.oo119x(r=0.997l4)。3个平行样为OD562=1.77，171，1.86，平均为1.78，从而A阴exinV的浓度为1.44mg/mLO同样的蛋白溶液测得OD280nln二1.800，OD260nln=l.760。带入经验公式得蛋白浓度:1.55xoD280一0.76又OD260气.45(mg/mL)。两种方法的结果能较好的吻合

【引证文献】