ZNF545表观遗传改变对肝癌热消融后复发的预测价值及微波和射频治疗肝癌的对照研究

发布时间：2020-08-05 15:11

【摘要】：目的：(1)研究ZNF545基因在肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)中的表观遗传学改变及对其表达的调控探讨ZNF545在HCC发生中的作用及作用机制。在此基础上,阐明ZNF545表观遗传改变对早期HCC超声引导下热消融治疗后转移复发的预测价值及其对HCC生存预后的影响,以期获得HCC诊断和预后的表观遗传学标志物。(2)采用随机对照研究(Randomized controlled trial, RCT)观察经皮水冷微波消融(Microwave ablation, MWA)与经皮水冷双极射频消融(Radiofrequency ablation, RFA)治疗早期肝细胞癌的中期疗效,为肝癌的临床微创热消融治疗方式选择提供进一步的理论及临床依据。(3)采用前瞻性队列对照研究,观察比较经皮水冷MWA及RFA与手术切除治疗早期肝细胞癌的中期疗效,为肝癌的治疗手段的选择提供理论依据。材料和方法：1、表观遗传研究：应用半定量RT-PCR方法在7株肝癌细胞系及一株永生化肝细胞系(HepG2、SMMC7721、SUN449、HBXF34、PLC-PRF-5、SK-Hep1、 BEL7402及LO2)中检测甲基转移酶抑制齐5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza-dc)处理前后ZNF545在mRNA的表达水平；应用甲基化特异性PCR检测7株肝癌细胞系、一株永生化肝细胞系、8例正常肝组织、10例肝硬化组织和101例HCC组织标本中ZNF545的甲基化情况；应用免疫组织化学染色检测20例具有石蜡包块的肝癌组织和配对癌旁组织中ZNF545的表达水平；克隆形成实验分析ZNF545对细胞生长的影响；流式细胞技术检测ZNF545对细胞凋亡的影响；利用MTT检测ZNF545对细胞增殖的影响；联合患者年龄、性别、肝功Child分级、甲胎蛋白、肿瘤数目、大小、病理分级、病毒含量、肝炎类型、消融后局部复发、肝内转移、生存等进行多因素分析ZNF545的甲基化情况与早期HCC热消融治疗后转移复发的相关性及其对HCC生存预后的影响。2、临床对照研究：(1)2008年10月至2013年1月满足以下入组标准在我院行超声引导下经皮消融治疗的290例HCC患者共364个病灶,按照计算机产生序号随机分为两组,其中MWA组146例192个病灶,RFA组144例172个病灶,入组患者满足以下标准：a)术前评估肝脏功能：Child-Pugh A或B级,凝血酶原时间25秒,凝血酶原活动度40%；b)单个结节直径≤5cm,结节数目≤3个；c)术前影像学检查及术中探查判断无明确的静脉、胆管癌栓和肝外转移；d)病理证实为HCC；e)术前无抗癌处理；f)自愿受试,术前均签署知情同意书。(2)满足以上入组标准2008年8月至2013年1月在我院行超声引导下消融治疗的290例HCC患者共364个病灶设为消融组,同期进行手术切除306例患者339个病灶设为手术组。分别观察比较两组治疗时间、术后住院日、住院费用、技术有效率(Technique effectiveness rate, TER)、局部肿瘤进展率(Local tumor progression, LTP)、肝内外转移率、并发症发生率和中期生存率。结果：1、表观遗传研究：MSP检测ZHF545基因在细胞系结果显示,HepG2、 SMMC7721、SUN449、PRF-PLC-5、 Sk-hep1及L02完全甲基化状态,Be17402呈部分甲基化状态及HBXF344呈未甲基化状态；经RT-PCR方法检测ZNF545基因mRNA水平上在肝细胞系Be17402及HBXF344中,经甲基转移酶抑制5-aza-dc处理前后无变化,其余肝癌细胞系经5-aza-dc处理后均恢复表达。恢复HepG2、SUN449中ZNF545的表达可抑制克隆形成和细胞增殖,促进细胞凋亡。在101例HCC组织中,ZNF545甲基化率为56.4%(57/101),在正常肝组织和肝硬化组织中均无甲基化改变提示ZNF545是一个潜在的HCC诊断的生物学标志物。单因素分析结果显示ZNF545甲基化阳性组65岁老年患者居多(P0.05)，多因素分析结果表明ZNF545甲基化虽然与12个临床因素均无统计学相关(P0.05)，但ZNF545甲基化表达阳性组肝内转移率和死亡率均呈明显增高趋势。2、临床对照研究：随访期为2～51.8月(中位时间19.8月)。(1)超声引导下经皮水冷MWA较水冷RFA治疗HCC需要更少的消融针数、消融次数、穿刺针数、消融时间和治疗费用(P0.05)，两组具有相似的TER、LTP、肝内外转移率、并发症发生率和中期生存率(P0.05)，但MWA在临近血管、胃肠、膈肌处肿瘤和3～5cm肿瘤消融中具有略好的局部肿瘤控制能力。(2)超声引导下经皮水冷热消融与手术切除治疗HCC相比，TER、LTP、中期生存率比较无显著差异(P0.05)，但手术治疗在3～5cm肿瘤中体现了更好的局部控制能力。消融组严重并发症的数量、种类和严重程度优于手术，需要更短的住院时间和更少的治疗费用(P0.05)，体现了经皮消融治疗的微创性。结论：1、表观遗传研究：ZNF545基因甲基化是肝癌的频发事件，ZNF545基因的表达受启动子区甲基化的调控，并抑制肝癌细胞的增殖，促进其凋亡。ZNF545基因的甲基化具有促进早期肝癌消融后肝内转移和死亡增加趋势，提示ZNF545甲基化是一个潜在的肝癌诊断及预后的指标，尚需大样本长随访病例以进一步明确ZNF545在不同分期肝癌热消融后的预测价值。上述基础及临床研究为揭示肝癌热消融联合表观遗传治疗奠定了理论基础。2、临床对照研究：在早期HCC的治疗中，(1)经皮水冷MWA和RAF取得了相似的中期疗效，但MWA在邻近重要结构的肿瘤和较大肿瘤消融中在局部肿瘤控制能力方面略占优势，MWA较RFA需要更少的治疗时间、次数和费用，减少了创伤，节约了医疗资源。(2)经皮水冷热消融治疗与手术切除取得了相似的中期生存疗效，虽然手术治疗对于较大肿瘤局部控制能力优于消融治疗，但消融体现了其微创、廉价、可重复治疗的优势。
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R445.1;R735.7
【图文】：

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解放军医学院博士学位论文因子来调控基因的转录。 ZF P 可以分为许多亚家族，其中 Kr ü pp e l -l i ke ( C ys 2H i s 2， C 2H 2 ) 型 ZF P 是其最大的亚家族，而 C 2 H2 型 ZN F 又可以根据其 N 端含有的结构域分成 4 大类：FA X ( f i ng e r- a s s oc o a t ed bo xe s ) 型， FA R (f i n ge r - a s s oc i at ed re p e at s ) 型， P OZ ( po x vi ran d z in c fi ng er s ) 和 KR AB (K r ü p p el -a s s oc i at ed b ox ) 型。含 KR AB 结构域的 ZF P 也称KR AB - Z F P ，结构特征是 N端含有 KR AB 结构域， C 端含有多个 C 2 H2 型锌指结构，这个家族的某些成员在N 端还含有一个S C AN 结构域 ( 图 1 -1 ) 。 KR AB -Z F P 占人类基因组中所有 ZF P (7 99 种 ) 的三分之一，是哺乳动物中最大的转录调控因子家族，在胚胎发育、细胞分化、细胞转化及细胞周期的调控中发挥重要功能，并随时间和空间的不同进行特异表达 [ 5] 。

位论,引物,区组,医学

解放军医学院博士学位论文探索，研究发现 ZN F 5 45 由于启动子甲基化而通常在胃癌组织中沉默或低表达，是胃癌的抑癌基因，其抗肿瘤生成功能是通过直接结合到 rD N A 启动子上、诱导组蛋白修饰、招募共抑制体和异染色蛋白体 1b 以及减少 rD N A 区组蛋白 H3 第四位赖氨酸 (H 3 K 4 ) 残基的三甲基化 ( 降低 H3 K 4 的转录活性 ) 从而抑制 rR NA 转录调节。 ZN F 5 4 5 在胃癌组织中甲基化率达到 51 . 9% ，其甲基化导致胃癌患者生存期显著缩短[ 6] ，这一初步研究结果是目前唯一有关 ZN F 5 4 5 基因与肿瘤发生关系的报道，却未能对该基因的表观遗传学调控机制进行研究。

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并对测序结果用 Bi oE d i t 生物学软件进行序列对比，并绘结果在肝癌细胞系中的甲基化改变准对照为 IV D，即仅能扩增出甲基化条带；非甲基化标准对照 h oc y t e DN A , NL )为正常人外周血淋巴细胞 DN A ，即仅能扩增出非甲应产物于 2% 的琼脂糖凝胶上进行电泳，大小位于 10 0～ 2 00 bp 之间，小符合 (图 1- 3 )。 8 株细胞系( H e p G 2、 S M M C 7 72 1 、S UN 4 4 9 、 LC -P R F- 5 、S K- H e p 1 、 BE L 7 40 2 、L O 2 )M S P 结果显示： HB X F 34 4 B E L 7 40 2 为部分甲基化，其余 6 株细胞系为完全甲基化 ( 图 1- 4 ) 。 IV D H2 O NL MK U M U M U M

【参考文献】