人胃内因子的分离、纯化及放免试剂盒研制

发布时间：2020-08-09 09:17

【摘要】： 前言人内因子(intrinsic factor IF)是由胃粘膜的壁细胞分泌的一种糖蛋白。其有两个活性部位，在摄入维生素B_(12)吸收的过程中，IF通过其中一个活性部位与摄入的维生素B_(12)结合形成复合物，从而保护维生素B_(12)不被小肠内水解酶破坏。然后再通过另一个活性部位与远端回肠上皮细胞膜上的受体结合，从而使维生素B_(12)被吸收。众所周知A型萎缩性胃炎患者因胃IF缺乏可引起恶性贫血，但有关血清IF水平与胃粘膜功能状态的研究报道不多。为了探讨血清IF水平与胃粘膜功能状态的关系，本研究分离纯化了人胃IF，并制作了放免试剂盒，最后采用放射免疫分析方法测定正常人及胃病患者血清中IF的含量。材料与方法 1 实验材料正常人胃组织来自中国医科大学法医学院，雄性家兔(大耳白)：两只，体重2kg，来自中国医科大学实验动物中心，血清标本来自青海省人民医院2000年10月至2001年8月住院患者，其中胃癌患者49例(术后2例)，年龄32—86岁；胃溃疡患者22例，年龄22—67岁；萎缩性胃炎患者25例，年龄20—65岁，均经内镜或病理检查证实。所有患者于清晨空腹安静状态下采血，分离血清，于-20℃冻存。正常血清标本来自中国医科大学附属一院献血员，共40例，年龄20—49岁。主要试药：DEAE-Sephadex A50、Sephadex G-75、CNBr Activa- t。d Seph删sc 4B（Ph。cia公司产品），Ac…咖de和伍s砒ylam－ ide石DSu 公司产品X低分子量标准蛋白质（上海丽珠生物有限公司产品X弗氏完全佐剂（本院免疫教研室提供入 Na”‘Iu 京原子能研究所X其它常规试剂为化学纯。 2实验方法半冰冻条件下刮取胃粘膜，用滤纸吸干，称重，剪碎，于 0．01 pH7．0磷酸缓冲液中制匀浆，经过两次离心，制成粗提液。取粗提液30ml加人用0．01M pH7．0磷酸缓冲液预平衡的 DEAE－SePhadex A50层析柱（3cm x 60cm），连续盐梯度洗脱， 280urn波长下测各管吸光度，绘制吸光度曲线，将各个蛋白峰分别收集起来，经缩水透析后，于－20℃保存。取上述第4峰透析液IInl加人已用0．01M pH7．0磷酸缓冲液预平衡的 SePhadex GJS层析柱（Icm x 60cm），用上述缓冲液洗脱，280run波长下测各管吸光度，绘制吸光度曲线，收集蛋白峰，经缩水过夜后，于－20℃保存。再取凝胶过滤层析第互峰浓缩液0．6rnl于偶联Vi风。的滇化氰活化的 Sepharose 4B亲和层析柱（0．6cm x 20cm）上，4℃条件下过夜，然后以高浓度盐酸肌梯度作为最后洗脱步骤洗脱，280urn波长下测各管吸光度，绘制吸光度曲线，收集蛋白峰。经缩水透析后，于一20℃保存。各蛋白峰蛋白质浓度测定采用酚试剂法。其分子量估计采用不连续SDS聚丙烯酚氨凝胶电泳法。用部分纯化的IF兔疫家兔制备抗血清，以双向兔疫扩散法勿．定抗体效价。纯化的 IF采用 lodosen法，用放射性‘’l标记。最后采用放免方法测定各组血清IF水平，其数据值范围均以 X。Sk表示，统计学差异性检验采用t检验。 ·2· 结果胃粘膜匀浆经离子交换层析共分离出5个蛋白峰，其第4峰经凝胶过滤层析的第二峰再经亲和层析共分离2个蛋白峰，第二峰经皿S－PAGE显示为一条带，分子量约为66 00。免疫家兔所得血清IF的抗体效价为二：32。各组血清IF放免测定结果：对照组为1．0584。0．4636pg／ml；胃癌组为 0．6784。0．2508 pgilnl；萎缩性胃炎组为 0．7040 L 0． 2220 pg／tnl；胃溃疡组为 0．9279。0．4898 pgllnl。胃癌组和萎缩性胃炎组患者血清IF水平明显低于对照组h＜0．ofh胃溃疡组与对照组比较血清 IF水平无统计学差异h＞0．05人胃癌组与萎缩性胃炎组比较血清 IF水平无明显差异帅＞0．05人胃溃疡组与胃癌组和萎缩性胃炎组比较差异不明显N．01＜p＜0．05人讨论 IF是摄人维生素B；。吸收所必需的辅因子，在体内其合成与分泌受多种物质影响。由于IF的含量较低，分离比较困难使其在临床方面的应用受到限制。为了探讨血清IF与胃粘膜功能状态的关系，特别是在胃癌时的变化，本研究采用离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析相结合的方法，成功分离了人的胃IF，经不连续SDS聚丙烯酚凝胶电泳显示为一条带，分子量大约为66 000。对胃病患者血清IF水平测定结果表明胃癌组患者和萎缩性胃炎组患者血清IF水平明显低于对照组，这可能是由于此两种疾病时，患者胃粘膜损坏导致壁细胞大量减少，从而使IF的合成与分泌减少引起的。众所周知，萎缩性胃炎是胃癌的癌前病变，二者血清IF水平无统计学差异，因此该结果表明较低的血清IF水平很 ·3· 可能是胃癌的高危指标，对于血清IF水平较低的体检者应该进一步做胃镜检查。在胃溃疡患者，血清IF水平与对照组比较无统计学差异，可能是由于胃溃疡时同时伴有广泛的胃粘膜炎性增生使壁细胞分泌IF的量增加，所以，尽管壁细胞数
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R817.4

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