超声联合载SDF-1微泡促MSC肾向归巢修复糖尿病肾病的实验研究

发布时间：2020-10-09 07:12

　　研究背景糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病的严重并发症,发病率高,当发展至终末期肾病阶段可造成患者死亡,目前尚无有效的治愈方法。因此,对糖尿病肾病进行早期干预以延缓病情进展,改善患者生活质量显得尤为重要。近年来细胞移植治疗糖尿病及其并发症已成为发展方向和研究热点。研究表明骨髓间充质干细胞(MSC)可修复胰腺,减轻肾损伤、加速肾小管增殖、促进肾功能的恢复。然而在干细胞治疗过程中,由于经静脉移植的MSC在DN肾脏中检出率很低,细胞难以到达病变组织,严重阻碍MSC对损伤肾脏的修复作用,因此迫切需要提高移植干细胞的肾向归巢能力。基质细胞衍生因子1(Stromal cell-derived factor-1,SDF-1)和它的特异性受体CXCR4构成的SDF-1/CXCR4轴是MSC归巢过程中最重要的分子通路。SDF-1能够强力诱导干细胞迁移归巢到损伤组织,具有抑制MSC的凋亡、增加MSC的存活率及增殖活性等作用。当组织损伤时,SDF-1在受损组织中的表达水平提高。文献报道,糖尿病患者的外周血中SDF-1/CXCR4水平降低,合并多器官损伤时下降更明显,可见SDF-1/CXCR4轴在糖尿病以及其并发症的发生、发展中起到重要的作用,因此,提高糖尿病肾病肾脏的SDF-1水平有望提高MSC的归巢能力。超声造影剂(微泡)可作为基因、蛋白质及药物的载体,在超声介导下实现药物靶向传输和基因转染。超声靶向击破微泡(Ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)技术可以提高肾间质的通透性,改变肾脏的微环境,促使局部细胞因子分泌,有利于MSC在靶组织的“着床”。本研究设想将SDF-1与微泡共价连接,经静脉注射进入循环,通过超声辐照靶向释放至肾脏,提高肾脏SDF-1的浓度,同时利用超声联合微泡产生的生物学效应改变肾脏微环境,促进静脉移植的外源性干细胞归巢至糖尿病肾病肾脏,达到改善MSC治疗效果的目的。探索该方法提高糖尿病肾病的MSC归巢效率、修复肾脏损伤的可行性,期望为增强糖尿病肾病的干细胞治疗效果提供一个新的视角。研究目的1.探讨微泡携载趋化因子SDF-1的可行性,评价载SDF-1微泡的理化性质、体内外生物学活性及超声显影能力。2.探讨诊断超声联合微泡对大鼠肾脏血管通透性的影响及安全性,观察超声联合载SDF-1微泡在肾脏靶向释放SDF-1,提高肾脏SDF-1浓度的可行性及有效性。3.对大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养并标记,用于体内移植示踪;建立大鼠早期1型糖尿病肾病模型,用于模仿人类疾病的发展及治疗。4.探讨诊断超声联合载SDF-1微泡促进静脉移植MSC归巢至糖尿病肾病肾脏的可行性。5.探讨诊断超声靶向释放SDF-1联合静脉移植MSC修复大鼠糖尿病肾病的可行性及有效性,为糖尿病肾病的治疗提供一种新的策略方法。研究方法1.采用全骨髓贴壁培养法提取、培养SD大鼠骨髓间充质干细胞。并通过CCK-8实验检测分析细胞生长曲线,流式细胞术观察细胞周期,透射电子显微镜、光学显微镜观察细胞的形态结构,综合判断其生物学特性。用流式细胞术对细胞的表面标记物进行检测,通过诱导细胞成脂及成骨分化判断其多向分化潜能。分别用绿色荧光蛋白慢病毒转染、CM-Di I染色、DAPI染色的方法对干细胞胞浆、胞膜及胞核进行标记,比较三种标记效果后选定合适的方法用于体内示踪。2.用碳二亚胺激活羧基的方法,将SDF-1与含有双端羧基官能团的聚乙二醇(COOH-PEG4000-COOH)共价连接,制备载SDF-1脂质微泡。通过光学显微镜观察微泡的形态、分布,颗粒计数器检测微泡的粒径及浓度。用异硫氰酸荧光素(FITC)标记SDF-1,制备载FITC标记SDF-1微泡。激光共聚焦显微镜下观察FITC标记的SDF-1与微泡的结合情况,流式细胞术检测SDF-1的携带率。酶联免疫吸附实验(ELISA)检测载SDF-1微泡中SDF-1的携载量及包封率,免疫蛋白印迹法(Western blot)检测SDF-1与PEG结合后的分子量变化。超声观察微泡在体外以及在肾脏的增强显影能力。将载SDF-1微泡溶解后,用CCK-8实验检测其对体外培养细胞增殖能力的影响,用细胞迁移实验检测其趋化干细胞的生物学活性。3.诊断超声联合微泡作用于大鼠左侧肾脏,以右侧未辐照肾脏作为对照,用透射电子显微镜观察大鼠肾脏血管超微结构改变,结合硝酸镧灌注法观察肾脏通透性的改变及其恢复情况。激光共聚焦显微镜观察超声靶向击破微泡技术在左侧肾脏靶向释放FITC标记SDF-1的效果。4.单次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)法建立大鼠早期1型糖尿病肾病模型,检测模型大鼠的血糖,尿糖,用HE染色、过碘酸雪夫染色(PAS)及免疫组织化学染色观察胰腺、左肾的病理组织学变化及左肾SDF-1表达情况。将健康大鼠及模型大鼠分为对照组(Control),超声靶向击破微泡组(UTMD),超声靶向击破载SDF-1微泡组(UTMD+SDF-1),对左侧肾脏进行分组实验,用ELISA、聚合酶链式反应(PCR)及Western blot比较各分组肾脏SDF-1水平的差异。将体外标记好的MSC经静脉移植入大鼠体内,激光共聚焦显微镜观察示踪24 h后MSC在各组左侧肾脏中的归巢数量。5.超声击破微泡靶向释放SDF-1联合经静脉移植MSC,观察该方法修复大鼠糖尿病肾病的效果。分为正常对照组(Normal),糖尿病肾病组(DN),糖尿病肾病+干细胞移植组(DN+MSC),糖尿病肾病+超声释放SDF-1组(DN+SDF-1),糖尿病肾病+超声释放SDF-1+干细胞移植组(DN+SDF-1+MSC),比较实验前、实验后4周、12周的治疗效果。监测大鼠血糖,检测24h尿白蛋白及尿肌酐,计算尿白蛋白/尿肌酐比值(ACR),评价肾功能。超声观察左侧肾脏大小、形态、实质回声、血流灌注及动脉血流阻力指数。HE染色观察胰腺病理变化。PAS及免疫组织化学观察左侧肾脏病理改变及转化生长因子-β1(TGF-β1)的表达变化。结果1.采用全骨髓贴壁培养法成功提取大鼠骨髓源性MSC,流式细胞术检测结果显示细胞表面标记物CD44、CD29和CD90阳性,CD34、CD45和CD11b阴性。细胞诱导分化实验证实培养的MSC具有成脂、成骨分化潜能。细胞生长曲线显示其具有旺盛的增殖能力,细胞周期检测结果显示大部分细胞处于G0+G1期,比例约83.00%。形态学观察细胞具有未分化细胞的特征。细胞可被GFP慢病毒转染,在胞浆及胞核表达强烈的绿色荧光,并可传代表达;可被CM-Di I标记,在细胞膜发出红色荧光;可被DAPI标记,在细胞核发出蓝色荧光。2.采用共价连接的方法成功制备得到载SDF-1脂质微泡。光学显微镜下载SDF-1微泡与普通微泡形态相似,为表面光滑规整的圆球形,经PBS稀释后分散良好,分布均匀。粒径检测结果显示,普通微泡粒径范围1.5~5mm,平均粒径约1.78mm,微泡浓度约5~9×109/m L;载SDF-1微泡粒径范围1.5~5mm,平均粒径1.92mm,微泡浓度约2~6×109/m L。SDF-1的包封率为79%,携载量为15.8mg/m L,携带率84.4%。激光共聚焦显微镜下可见FITC标记的SDF-1微泡表面呈现出明亮的绿色荧光。Western blot检测结果显示SDF-1(分子量约8 k D)与双端羧基PEG(分子量4 k D)结合后分子量发生变化,出现三个不同分子量的条带,分子量分别为8 k D、12 k D及20 k D。低机械指数超声造影模式下,普通微泡与载SDF-1微泡均能产生强烈的声学信号,成像能力出色,微泡在大鼠肾脏微血管充盈良好,有良好的增强显影能力。CCK-8实验证实超声溶解后的微泡溶液对体外培养的干细胞无明显毒性作用。细胞迁移实验证实载SDF-1微泡溶液具有与SDF-1相似的趋化MSC迁移的能力,AMD3100能抑制该趋化作用,证实其保留有趋化干细胞的生物学活性。3.诊断超声联合微泡作用于大鼠左侧肾脏,超微结构显示血管内皮细胞连续性中断,细胞间紧密连接开放,血管通透性增加,硝酸镧示踪剂漏出至血管外的间质中,24h后通透性可恢复正常。激光共聚焦显微镜下可见FITC标记SDF-1被成功地靶向释放至左侧肾脏。4.单次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)后3天,大鼠血糖持续在16.7 mmol/L以上,大鼠出现多饮、多食、多尿,体重减少等典型的糖尿病症状,证明糖尿病模型成功建立。4周后,尿微量白蛋白排泄率大于30 mg/24 h,初步判定早期糖尿病肾病模型成功建立。免疫组织化学染色结果显示肾脏SDF-1呈弱表达,而正常肾脏几乎不表达。ELISA结果显示DN组肾脏SDF-1浓度高于健康大鼠(1010.44±88.53 pg/m L VS 208.03±42.34pg/m L,P0.05)。UTMD后即刻DN与健康大鼠肾脏SDF-1浓度无明显升高,6 h后分别升高至(1257.68±103.88)pg/m L及(401.78±50.13)pg/m L,UTMD+SDF-1后即刻DN与健康大鼠左肾SDF-1浓度显著上升,分别达到(1750.08±131.36)pg/m L和(760.97±91.85)pg/m L,6 h后浓度继续升高达(2120.23±159.75)pg/m L和(953.89±79.33)pg/m L,与未处理组及UTMD组相比差异均有统计学意义(P0.05)。PCR结果显示UTMD及UTMD+SDF-1后即刻,健康大鼠与DN大鼠SDF-1的m RNA表达均无明显提高,而6 h后表达均有显著增高(P0.05)。Western blot结果显示健康大鼠左肾SDF-1表达极少,UTMD后即刻SDF-1表达无变化,6 h后略有增加,UTMD+SDF-1后即刻表达增加(P0.05),6 h后增加更明显。DN大鼠左肾SDF-1弱表达,UTMD后即刻表达无变化,6 h后略有增加,UTMD+SDF-1后即刻蛋白含量增加(P0.05),6 h后SDF-1增加最明显,与各组相比差异均有统计学意义(P0.05)。分组实验后移植GFP标记的MSC,24 h后MSC在DN大鼠UTMD+SDF-1组肾脏发现的阳性细胞数量达(23.8±3.61)个,远高于DN组的(3.6±2.07)个(P0.05)。5.血糖监测结果显示,未进行干预的糖尿病大鼠血糖呈进行性升高,由(22.93±6.51)mmol/L上升至DN成模12周的(30.25±4.78)mmol/L,与DN+SDF-1组表现相似。移植MSC后,无论是否靶向释放SDF-1,血糖浓度均下降,第2周降至最低水平后维持在22 mmol/L左右,但均未能回归至正常水平的(4.67±1.04)mmol/L。尿样生化检测结果显示,DN组及DN+SDF-1组的ACR值随时间逐渐上升,至12周时分别为(660.32±70.21)mg/mg和(620.39±50.83)mg/mg,高于相同时间点的正常大鼠115~126mg/mg。DN+MSC组和DN+SDF-1+MSC组的ACR值明显降低,至12周时分别为(350.23±54.47)mg/mg和(278.23±51.34)mg/mg。DN+SDF-1+MSC组的ACR水平低于DN+MSC组(P0.05)。超声检查发现,糖尿病肾病大鼠4周内实质回声及彩色血流均无明显变化,至12周时实质回声增强,血流灌注减少,动脉阻力指数升高达0.71±0.16。DN+SDF-1组无明显改善。DN+MSC组12周时左肾实质回声略增强,血流灌注有所改善,RI降至0.63±0.12。DN+SDF-1+MSC组左肾实质回声及血流灌注改善更明显,RI降至0.60±0.14。病理检查发现,腹腔注射STZ后,大鼠胰腺内的胰岛结构数量逐渐减少,体积逐渐减小,肾脏细胞外基质的面积出现逐渐增加的趋势,12周后胰岛结构少见,体积小而形态多样,细胞排列极为紊乱,失去正常的胰岛结构。肾脏出现肾小球硬化、系膜增生、基底膜增厚的表现。DN+SDF-1组胰岛、左肾病理组织形态学无明显改善。DN+MSC组及DN+SDF-1+MSC组胰岛病理组织学有所改善,左肾损伤程度明显弱于DN组及DN+SDF-1组,虽然不能逆转病变进展,但亦未出现进行性加重的现象。肾组织致纤维化因子TGF-β1免疫组化染色后发现,正常肾组织TGF-β1呈弱表达,DN与DN+SDF-1组左肾表达增加,并随病情加重持续增加。DN+MSC组与DN+SDF-1+MSC组4周后左肾TGF-β1表达无明显增加,12周后均有增加趋势,但均明显弱于同时间点的DN组及DN+SDF-1组,DN+SDF-1+MSC组抑制左肾TGF-β1表达的效果优于DN+MSC组。结论1.通过全骨髓贴壁细胞培养法成功提取、培养大鼠骨髓源性MSC,获得的细胞具有低分化、高自我更新能力、多向分化潜能的特点,可分别用GFP慢病毒转染、CM-Di I标记及DAPI标记在细胞浆、细胞膜及细胞核上标记荧光。2.通过共价结合成功制备载SDF-1微泡,其粒径符合体内注射要求,稳定性好,浓度高,SDF-1的携载量及携带率均较高。载SDF-1微泡在体内及体外均具有良好的超声显影能力,对体外培养的骨髓间充质干细胞无明显的毒副作用,同时保留趋化干细胞的生物学活性。3.腹腔单次注射STZ(60mg/Kg)4周后可建立稳定的大鼠早期1型糖尿病肾病模型。4.超声靶向微泡击破技术可以提高肾组织通透性,并且具有可恢复性。5.超声击破载SDF-1微泡可将SDF-1靶向释放至肾组织,通过提高靶区组织的SDF-1浓度,改变肾脏微环境及增加血管通透性,可以促进移植的外源性干细胞的肾向归巢能力,6小时内是移植MSC的适宜时机。6.移植MSC可以修复糖尿病大鼠受损的胰岛,降低血糖,改善糖尿病肾病大鼠肾脏功能,降低TGF-β1的表达,抑制肾小球、肾间质纤维化进展。7.超声击破载SDF-1微泡提高SDF-1浓度,通过增加外源性MSC的肾向归巢效果,更有效地延缓糖尿病肾病的进展,对肾脏的修复作用优于单纯的MSC移植。
【学位单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R445.1;R587.2
【文章目录】：
缩略语表
英文摘要
中文摘要
第一章前言
第二章 SD大鼠骨髓间充质干细胞的培养及标记
    2.1 材料与方法
    2.2 结果
    2.3 讨论
    2.4 小结
第三章载SDF-1 微泡的制备、表征及体外生物学活性研究
    3.1 材料与方法
    3.2 结果
    3.3 讨论
    3.4 小结
第四章超声联合载SDF-1 微泡促MSC在早期糖尿病肾病大鼠中的肾向归巢
    4.1 材料与方法
    4.2 结果
    4.3 讨论
    4.4 小结
第五章超声击破载SDF-1 微泡联合静脉移植MSC对大鼠早期糖尿病肾病的修复效应
    5.1 材料与方法
    5.2 结果
    5.3 讨论
    5.4 小结
全文总结
创新点和新颖性
不足之处和研究展望
参考文献
文献综述超声微泡造影剂在靶向治疗中的应用研究
    参考文献
攻读博士学位期间的研究成果
致谢

【参考文献】