新型多聚体微泡介导的基质金属蛋白酶-2靶向显像实验研究

发布时间：2020-11-07 11:06

　　 实验一实时心肌超声造影对大鼠心肌微循环灌注的评价 目的:探讨实时心肌超声造影对大鼠心肌微循环灌注的评价中的应用价值。 方法:雄性SD大鼠(n = 12),手术结扎冠状动脉左前降支(LAD)前后分别进行经静脉团注/连续滴注超声造影剂BR1进行实时心肌超声造影(RT-MCE)。对心肌内声学强度进行连续分析。以组织图像为参考,在造影图像中分别在LAD供血区和LCx供血区放置两个感兴趣区。根据心电图信号,自动选择舒张末期( ED )和收缩末期(ES)的系列图像,并单独分析在每个时间点下每个兴趣区的信号强度。连续滴注中,心肌声学强度(SI)随时间的变化符合指数函数关系:Y=A(1- e-βt),其中Y代表任何给定时间的心肌SI;A代表曲线平稳时期SI;β代表SI上升率(曲线斜率);t代表FLASH后的时间。通过A和β的乘积代表心肌血流量(MBF)。团注中,心肌内SI随时间的变化曲线符合伽马变量函数:y =At-e-αt,其中Y代表心肌信号强度,t代表时间,A为比例系数,α值与造影剂的传输速度成正比,峰值信号强度(PSI)A/αe。超声造影之后,经静脉注射1.5mCi的99mTc-sestamibi,测定心肌内核素含量作为评价心肌灌注的指标。 结果:连续滴注及团注在冠脉结扎前后均未对大鼠心率造成明显影响。结扎LAD后,有部分大鼠出现1至2次的室性早搏。基础状态下,大鼠左室心肌各节段室壁增厚率无显著性差异;冠状动脉结扎后,与LCx灌注区的增厚率相比,LAD灌注区的室壁增厚率明显减低(LAD灌注区: 21.86±5.03 vs LCx灌注区:57.41±10.58, p0.01)。单次0.4ml/kg团注和0.9ml/kg?min BR1连续滴注均获取了乳头肌水平高质量的实时造影短轴图像。基础状态,左心室腔内、LAD灌注区和LCx灌注区心肌内的信号持续增强,且均匀一致,(连续滴注:A*βLAD: 48.27±3.72dB, A*βLCx: 47.89±5.43dB, p0.05;团注:PSI LAD: 48.27±3.72dB, PSI LCx: 47.89±5.43dB, p0.05)。LAD结扎后,左心室的LAD灌注区心肌内可观察到明显的造影剂灌注缺损(连续滴注:A*βLAD: 5.42±1.57dB, A*βLCx: 46.52±5.32dB, p0.05;团注:PSI LAD: 2.11±0.67dB, PSI LCx: 20.68±0.72 dB, p0.05)。两种超声造影方法所计算的心肌灌注缺损面积结果间无明显差异(连续滴注:29.5±13.3% vs.团注:29.67±13.1%, P0.05),且这两种方法均与组织样本的伊文氏蓝染色有良好的相关性。(连续滴注:r = 0.95;团注:r = 0.94)。在舒张末期,团注中的PSI值和连续滴注中的A*β值均高于收缩末期。但是,各项参数的LAD/LCx比值无明显变化(P0.05)。舒张末期大鼠心内膜图像显示优于收缩末期图像。 结论:RT-MCE技术可对大鼠的心肌灌注和心肌收缩功能可进行定量和定性的评估,均具有较好的可行性。定量评价心肌灌注方面要优于团注;但造影剂团注后缺血区域与正常区域的PSI比值(PSIratio)可用于定量评估心肌梗塞前后梗死区域心肌的心肌灌注。RT-MCE可实时定性评估心肌微循环灌注。与连续滴注相比,团注由于造影剂相对浓度较高更便于通过肉眼观察把识别灌注缺损区域BR1。舒张末期图像比收缩末期图像更适合于心肌灌注分析。 实验二新型多聚体靶向超声造影剂的实验研究 目的:研制一种具有靶向结合能力的新型多聚体型超声微泡。 方法:将聚乙二醇(PEG)、糖类物质、脂类物质、磷脂类物质、聚合物、改性蛋白质、表面活性剂、高级脂肪醇类或高级脂肪酸类的一种或几种按不同的比例制成微泡膜材料,通入六氟化硫(SF6)气体同时用超声处理仪声振处理上述冷却后的成膜溶液,得到微泡悬浮液。采用上浮法进行微泡的分级分离。对不同成膜溶液制成的多聚体型微泡的直径、浓度、稳定性进行测定,确定最佳成膜溶液配制方案。将微泡与基质金属蛋白酶单克隆抗体共浴后,制成靶向微泡,应用荧光显微镜、流式细胞仪确定荧光标记的单克隆抗体与微泡表面的结合。 结果:各种聚乙二醇、乳化剂及稳定剂的选用和配比比例及微泡膜溶液中油相和水相的比例均会对所制备微泡造影剂的浓度、稳定性、弹性等性质产生影响。通过对成膜材料的配比进行优化,可得到一种较为理想的新型多聚体微泡造影剂,其微泡直径为3.36±1.62μm,造影剂溶液终浓度为约为7×109/ml,常温下可保存5天,4°C下保存2个月。免疫荧光结果显示结合了荧光标记的抗体的多聚体微泡表面显示出绿色、均匀一致的强荧光。流式细胞仪亦证实了微泡与带荧光抗体的有效链接。 结论:新型多聚体微泡具有良好的理化性质,其中分子量愈高的聚乙二醇制得的微泡愈稳定。新型多聚体微泡通过其表面的PEG空间结合臂可有效的与抗体结合形成靶向微泡,成为微泡介导的超声靶向实验研究的理想选择。 实验三特异性超声靶向造影剂对心肌缺血再灌注后心肌重构中MMP-2的显像 目的:基质金属蛋白酶-2(MMP-2)与心肌缺血再灌注(I/R)后心肌重构过程有密切联系。本实验拟证明新型多聚体型超声造影剂表面可携带MMP-2抗体,具有对MMP-2进行靶向显影的功能。 方法:将六氟化硫通入含聚乙二醇(PEG)等物质的成膜溶液中,用超声声振法制成一种新的多聚体型微泡,作为正常对照(MBc)。将MMPs-2 IgG1单抗与1x107 MBc于4℃反应10min,制成MMP2-靶向性MB (TMB2)。SD大鼠28只,随机分为缺血再灌注(I/R)一周组(n=14)和正常对照组(n=14)。两组中各取两只大鼠进行特异性超声靶向造影剂体外靶向结合试验。各组中其余12只大鼠再随即分为两组,分别与特异性MMP2靶向造影剂(n=6)及正常对照造影剂(n=6)进行的体内结合试验。体外实验将TMB2和MBc与组织切片共浴后,清洗掉未与心肌组织结合的微泡,在光学显微镜下观察微泡在心肌组织切片上的分布。体内试验,首先通过静脉持续滴注Sonovue15min结合低频高能量超声触发显像增强微血管通透性。10min后,分别将0.2ml TMB2/MBc缓慢注射入两组大鼠体内。手动触发高能量(MI=0.60) FLASH影像,观测心肌内正常区域及心肌重构区域内回声强度。 结果:体外实验中,心肌缺血再灌注后缺血区域心肌较正常对侧心肌明显变薄;TMB2在缺血区域心肌内聚集,在正常对侧心肌内未见特异性造影剂微泡聚集。获取心脏后观察发现,前间隔、前壁、侧壁可见多少不等的出血点,提示局部微血管渗透性增加后有红细胞漏出。在I/R组大鼠中,和MMP2-靶向性微泡TMB2反应的6只大鼠中有4只在心肌重构区域里观察到MMP2-靶向性微泡TMB2的滞留,显示为局部回声增强,且明显高于对侧正常心肌的声学强度。而正常对照微泡MBc在I/R组大鼠的心肌内均未见明显滞留。对照组大鼠中,两种微泡均未见明显的滞留。 结论:当微泡被高能量、低频率超声破坏时,其瞬时所产生的“声空化”效应能产生局部、小范围的毛细管渗漏,为潜在的靶向治疗及靶向显影提供了机会。新型多聚体型超声造影剂利用其膜表面的PEG空间臂可携带MMP-2抗体,通过抗原-抗体反应具有对MMP-2进行靶向显影的功能。
【学位单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2009
【中图分类】：R445.1
【部分图文】：

特异性配体与靶向微泡的结合方式。A：直接连接；B：特异性靶向微泡造影剂在疾病诊断上的进展微泡造影剂的研究集中在小分子配体上。如PRL肽、RGD肽等[3配受体系统（如生物素与抗荧光素抗体）也被用于生物医学相38,39]。但是在实际应用中，抗体介导的靶向微泡使用中会受到血限制，因为大部分抗体在高剪切力的血流中不能迅速地与配体的血流阻断被用来增强微泡的靶向效应。无破坏性的低声压超直流，能导致微泡从血流中心向血管壁运动，避免高剪切力状高速血流中的靶向成功率[41]。另外。使用快速结合的靶向配体高靶向成功率。

基础状态，左心室各节段室壁增厚无明显差异（LA57.19±9.12 vs LCx 灌注区：55.87±11.47, p>0.05）。冠状动脉结扎灌注区的增厚率相比，LAD 灌注区的室壁增厚率明显减低（L21.86±5.03 vs LCx 灌注区：57.41±10.58, p<0.01）。2.3 实时心肌灌注这项研究中，在所有 0.4ml/kg 团注和 0.9ml/kg min BR1 连续了乳头肌水平高质量的实时造影短轴图像，无需追加造影剂。图1显示基础状态和LAD结扎后连续滴注BR1的造影短轴图强度曲线。基础状态，左心室腔内、LAD灌注区和LCx灌注区心持续增强，且均匀一致，也未出现后壁声影（图1A, B;A*βLAD: 48A*βLCx: 47.89 ± 5.43dB, p>0.05）。LAD结扎后，左心室的LAD灌可观察到明显的造影剂灌注缺损，此处的A*β值也明显降低（图LAD: 5.42 ± 1.57dB, A*βLCx: 46.52 ± 5.32dB, p<0.05）。

第四军医大学博士学位论文团注的造影结果与连续滴注基本相似。在团注后，前壁心肌信号显著增强，但由于左室心腔内的造影剂浓度较高形成声影，影响了对壁灌注的观察，在本实验中这一现象仅维持约 5 秒钟，当造影浓度被左心室腔和所有心肌的信号均显示均匀一致的增强，无明显的后壁声2A，B; PSILAD: 48.27 ± 3.72dB, PSILCx: 47.89 ± 5.43dB, p>0.05）。LA后，可以在左心室的LAD灌注区观察到明显的灌注缺损和局部SI减低（D; PSILAD: 2.11 ± 0.67dB, PSILCx: 20.68 ± 0.72 dB, p<0.05）。可证明LA手术的成功。
【引证文献】

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1 李慎义;陈莉;;前列腺癌超声造影的研究进展及临床应用[J];南昌大学学报(医学版);2011年08期

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1 李慎义;超声造影在前列腺癌诊断中的临床应用研究[D];南昌大学;2012年

本文编号：2873857