辐射诱导非小细胞肺癌CHMP4C表达及其机制研究

发布时间：2017-09-10 04:32

  本文关键词：辐射诱导非小细胞肺癌CHMP4C表达及其机制研究

  更多相关文章： CHMP4C AuroraB 非小细胞肺癌 辐射

【摘要】：背景肺癌是全球范围内发病率与死亡率非常高的恶性肿瘤。非小细胞肺癌占肺癌的85%左右。放射治疗是晚期非小细胞肺癌的主要治疗方式。肺腺癌对于放射治疗的敏感性相对较低。如何提高肺腺癌病人的放疗疗效,为病人制定更为特异和优化的治疗方案从而更好的提高患者的生存率,是非常重要且广受关注的问题。最近的研究发现,作为内涵体分选复合物-Ⅲ(ESCRT-Ⅲ)的一个亚基,CHMP4C在细胞分裂最后阶段的细胞剪切检查点(Abscission checkpoint)中发挥着关键性的监控作用。CHMP4C基因主要负责暂时中止剪切过程直至“滞后”染色体完全分离并进入到新的细胞中,以防止细胞过早分离,从而阻止遗传损害的发生。CHMP4C的这一功能,主要受AuroraB的精确调控来得以实现。而且CHMP4C在正常组织中低表达,而在肿瘤细胞中高表达。然而,辐射对CHMP4C表达的影响,CHMP4C在辐射诱导的细胞响应中的功能,以及对非小细胞肺癌辐射敏感性的影响及其机制仍然不清楚。目的本研究旨在探讨辐射诱导CHMP4C表达及其机制。分析辐射诱导CHMP4C表达情况以及CHMP4C在辐射诱导的细胞响应中的功能。并通过研究CHMP4C与p53或AuroraB介导的信号传导通路之间的关系,进一步探寻CHMP4C参与非小细胞肺癌辐射敏感性的机制,为提高非小细胞肺癌的放射治疗疗效提供新的参考和依据。方法1. CHMP4C对A549细胞活性、细胞凋亡和细胞周期的影响。A549细胞转染siCHMP4C 48h后,alamarBlue检测细胞活性；caspase-GloR 3/7 reagent检测caspase 3/7活性；流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期；Western blot检测细胞周期调控相关蛋白Cyclin A, Rb, Cyclin B1和cdc2的蛋白表达水平。2. AuroraB对CHMP4C的调控作用。A549(p53+/+)和H1299(p53-/-)细胞转染siAuroraB或siCHMP4C 48h后,Western blot检测AuroraB和CHMP4C的蛋白表达水平,Real-time PCR检测AuroraB和CHMP4C的mRNA表达水平。AZD1152-HQPA抑制A549和H1299细胞的AuroraB功能后,Western blot检测CHMP4C的磷酸化水平。A549和H1299细胞转染pcDNA3.1-AuroraB以高表达AuroraB, Western blot检测AuroraB蛋白表达水平和CHMP4C的磷酸化水平。3.辐射对CHMP4C和AuroraB表达的影响。A549和H1299细胞接受2Gy照射后不同时间点(0,4,8,24,48h),或接受不同剂量(0,2,4,6Gy)照射后24h,Western blot分析CHMP4C蛋白表达水平和磷酸化水平以及AuroraB蛋白表达水平。A549细胞转染sip53后接受2Gy照射,Western blot检测p53和CHMP4C的蛋白表达。4. AuroraB或CHMP4C对细胞辐射敏感性的影响。A549和H1299细胞分别转染pcDNA3.1-AuroraB/CHMP4C或si-AuroraB/CHMP4C后,接受不同剂量(0,2,4,6Gy)照射,使用克隆形成实验检测AuroraB或CHMP4C对细胞辐射敏感性的影响。5. CHMP4C对辐射诱导的细胞周期和细胞凋亡的影响。A549和H1299细胞转染sip21或siCHMP4C 24h后接受2Gy照射,照射后24h利用流式细胞术分析细胞周期进程,Western blot检测A549细胞p21和CHMP4C的表达；A549细胞转染siCHMP4C 24h后接受6Gy照射,照射后24h利用流式细胞术分析细胞凋亡。6. CHMP4C对DNA损伤修复能力的影响。细胞转染siCHMP4C 24h后接受4Gy照射,照射后30min利用荧光显微镜检测yH2AX和53BP1焦点形成。结果1.CHMP4C对A549细胞活性、细胞凋亡和细胞周期的影响。与对照组相比,抑制CHMP4C可以降低细胞活性,增强Caspase3/7活性,促进细胞凋亡,引起细胞周期S相延迟并增强Rb和cdc2的磷酸化水平,提高CyclinBl的表达水平,降低CyclinA2的表达水平。2. AuroraB对CHMP4C的调控作用。沉默AuroraB表达后,CHMP4C的蛋白表达水平明显降低,CHMP4C的mRNA表达水平没有发生变化。然而沉默CHMP4C对AuroraB的蛋白表达水平没有影响。高表达AuroraB可以提高CHMP4C的磷酸化水平而抑制AuroraB的功能可以降低CHMP4C的磷酸化水平。3.辐射对CHMP4C和AuroraB表达的影响。细胞接受2,4,6Gy照射后,A549细胞中CHMP4C蛋白表达水平增高并在24h达到最高水平,而H1299细胞中CHMP4C蛋白表达水平却没有增高,但是A549和H1299细胞中CHMP4C磷酸化水平和AuroraB表达水平均增高。细胞接受照射后,缺失p53功能的A549细胞中CHMP4C蛋白表达水平没有增高。4. AuroraB或CHMP4C对细胞辐射抗敏感性的影响。在克隆形成实验中,与单纯转染siCHMP4C组和单纯照射组细胞相比,沉默CHMP4C并接受照射组细胞存活分数明显下降,然而高表达CHMP4C组的细胞存活分数升高。同时,在AuroraB沉默或高表达细胞中出现了相似的结果。5. CHMP4C对辐射诱导的细胞周期和细胞凋亡的影响。抑制A549和H1299细胞CHMP4C表达可以诱导细胞周期S相延迟。与单纯抑制CHMP4C表达相比,抑制CHMP4C表达后再接受2Gy照射组细胞表现出更为严重的S相延迟。同时,抑制A549细胞中p21的表达可以引起相似的现象。此外,沉默CHMP4C不会影响p21蛋白表达,沉默p21也不会影响CHMP4C蛋白表达。并且,同时沉默CHMP4C和p21表达会引起S相延迟的叠加效应。相对于单纯抑制CHMP4C组和单纯照射6Gy组细胞,抑制CHMP4C表达联合6Gy照射组的细胞凋亡更为严重。6. CHMP4C对DNA损伤修复能力的影响。抑制CHMP4C表达可以降低H2AX的磷酸化水平,减少γH2AX和53BP1焦点招募到DNA损伤处,从而影响DNA损伤修复的能力。结论1.抑制CHMP4C表达能够降低A549细胞的增殖能力；2.抑制CHMP4C表达可以增强非小细胞肺癌的辐射敏感性；3. CHMP4C介导非小细胞肺癌辐射敏感性的功能与AuroraB信号传导通路相关,可能不依赖于p53。
【关键词】：CHMP4C AuroraB 非小细胞肺癌 辐射
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2;R730.55
【目录】：

• 摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 英文缩略词表13-14
• 引言14-16
• 第一章 绪论16-38
• 1. 非小细胞肺癌治疗研究进展概述16-17
• 2. 辐射增敏相关研究17-31
• 3. CHMP4C相关研究进展31-38
• 第二章 材料与方法38-50
• 1. 主要材料与试剂38-39
• 2. 仪器设备39-40
• 3. 实验方法40-49
• 4. 统计学分析49-50
• 第三章 结果50-65
• 1. CHMP4C在非小细胞肺癌A549细胞中的功能研究50-53
• 2. AuroraB对CHMP4C的调控作用53-55
• 3. CHMP4C影响非小细胞肺癌辐射敏感性及相关机制研究55-60
• 4. p53缺失对辐射诱导的CHMP4C表达及其功能影响的研究60-65
• 第四章 讨论65-79
• 1. CHMP4C在非小细胞肺癌A549细胞中的功能分析66-70
• 2. CHMP4C对非小细胞肺癌辐射敏感性的影响70-72
• 3. CHMP4C对DNA损伤修复的影响72-73
• 4. CHMP4C介导非小细胞肺癌辐射敏感性的机制分析73-75
• 5. 本研究中涉及的信号传导通路探讨75-79
• 第五章 总结和展望79-80
• 1. 结论79
• 2. 创新点79
• 3. 展望79-80
• 参考文献80-109
• 作者简介109-110
• 致谢110

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本文编号：824758