弗林酶靶向的新型肿瘤PET探针的制备及性能研究

发布时间：2017-09-16 18:43

  本文关键词：弗林酶靶向的新型肿瘤PET探针的制备及性能研究

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【摘要】：肿瘤的早期诊断是人类对抗肿瘤的一个重要因素。在肿瘤的诊断技术中,正电子断层显像(PET)因其具有早期、灵敏和准确地诊断肿瘤的优点而得到了日益广泛的应用。开发新型PET探针对于扩展PET的临床应用非常重要。为获得较好的PET显像效果,针对特定靶标设计的PET探针能够通过靶标识别有效的到达靶向位点,从而增强PET显像的特异性。本论文设计的PET探针的靶标是弗林蛋白酶(furin),furin是一种重要的内切蛋白酶,在多种肿瘤中表达上升,增加肿瘤侵袭性和生长速度,因此设计靶标为furin的PET探针可以对肿瘤进行早期诊断。本论文设计新型靶向furin的肿瘤PET探针~(18)F-FBCKR,该探针首次将furin靶标识别、酶控纳米自组装技术与PET成像技术相结合,利用一个新型的缩合反应,设计了靶向furin的小分子PET探针。该PET探针~(18)F-FBCKR包含如下几个功能组成部分:(1)furin靶向基团—RVRR肽链用于furin识别剪切;(2)双硫键保护的半胱氨酸(Cys)提供1,2-氨基硫醇和分子中的2-氰基苯并噻唑(CBT)的氰基部分用于缩合反应;(3)赖氨酸(Lys)基团用于连接CBT和Cys,Lys的侧链ε-氨基上连接~(18)F-FBA基团用于PET显像。该探针通过肿瘤细胞高表达的furin识别摄取进入细胞,剪切水解后发生缩合反应继而自组装,从而在肿瘤细胞内控制性地合成放射性纳米粒子,浓聚放射性活性,用于肿瘤的靶向PET成像。因纳米粒子具有大的表面积和表面积与体积比,可以有效地提高生物组织局部的成像剂浓度,提高成像的灵敏性,已成为PET探针的研究热点之一。本论文设计合成的PET探针具有高度靶向性和智能组装功能,从而克服了普通纳米粒子合成难、摄取率低、靶向性差等问题。首先进行标记前体CKR和无放射性的冷化合物FBCKR的合成。合成方法简便直接,用制备高效液相分离得到纯品,进行核磁、质谱等化学结构确证。为验证furin控制的酶切和自组装性能,利用冷化合物FBCKR进行体外纳米粒子制备。将FBCKR和furin在缓冲液中37℃共孵育,通过HPLC分离出产物,进行质谱验证。HPLC图谱中的峰确证为FBCKR的酶切和缩合产物---二聚体,该条件下的酶切反应2h即完成且这种二聚物直到8小时都稳定。将上述培养液直接进行SEM和TEM,SEM图里平均纳米直径为207±99nm,TEM里平均纳米直径为182±70nm。进行了~(18)F标记合成~(18)F-FBCKR。在多功能合成模块上全自动合成了~(18)F-SFB,再与标记前体CKR进行反应,采用HPLC制备分离。进行了合成条件的优化,最佳的反应pH值为7.2,反应温度为50℃,反应时间为0.5h。~(18)F-FBCKR的质检结果表明该产品符合注射用药的要求;稳定性实验结果表明37℃时~(18)F-FBCKR在生理盐水和血清中直到5h都稳定。进行细胞实验来验证~(18)F-FBCKR和FBCKR的细胞性能。首先进行western blot实验来验证MDA-MB-468细胞的furin表达水平,LoVo细胞作为空白对照,结果显示MDA-MB-468有较强的furin表达(31.2%的β-actin)而LoVo的furin表达很弱(10.4%),证明MDA-MB-468适用于本实验。接着验证了FBCKR的生物相容性,MTT实验结果显示化合物对细胞毒性较低。然后将FBCKR与MDA-MB-468肿瘤细胞在37℃共同培养进行了细胞显像实验,结果证明了FBCKR摄取进入细胞后被furin剪切缩合形成了含有荧光素结构的缩合产物,且产物的位置就在furin的位置(高尔基体)上,并且用高倍电镜直接观察到纳米粒子的生成。~(18)F-FBCKR和MDA-MB-468细胞共培养进行的摄取实验显示培养60min后,细胞摄取即达到平衡,摄取率为22.2%,说明~(18)F-FBCKR的细胞摄取能力较好。~(18)F-FBCKR的细胞洗出实验结果表明,不加FBCKR组和细胞共同培养120min后仅有13.1±1.2%的放射性保留,而加5、25、50μM FBCKR组的放射性保留率分别达到20.3±4.2%,28.5±1.4%,32.1±0.9%。洗出实验结果表明FBCKR的加入可以增加化合物的化学量,饱和细胞内的游离Cys从而保证自组装的顺利进行形成放射性纳米粒子,增加放射性保留率。最后进行了~(18)F-FBCKR的Micro-PET显像实验。~(18)F-FBCKR和FBCKR共注射进行了MDA-MB-468肿瘤裸鼠的不同时间点MicroPET扫描,同时设立单注射~(18)F-FBCKR组作为对照。~(18)F-FBCKR组在30和60min肿瘤可见但衰减很快,而共注射组在30-360min肿瘤均清晰可见。放射性数据分析显示~(18)F-FBCKR和FBCKR共注射组的肿瘤摄取分别是~(18)F-FBCKR组的2.5(10 min),3.6(30 min),6.4(60 min),7.9(120 min),8.2(240 min)和6.5倍(360 min)。这些结果显示~(18)F-FBCKR有很好的体内肿瘤摄取率,但~(18)F-FBCKR和FBCKR共注射有更好的肿瘤摄取和更慢的放射性衰减,进一步证明了FBCKR的加入促进了化合物在肿瘤区域的自组装和放射性纳米粒子的形成,增强PET显像效果。通过以上的制备和性能研究显示本论文设计的新化合物~(18)F-FBCKR是有应用前景的PET探针。
【关键词】：弗林酶 PET探针 纳米粒子 自组装
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.44;TB383.1
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 主要缩略符号说明7-11
• 第一章 绪论11-31
• 1.1 肿瘤的PET诊断11-18
• 1.1.1 肿瘤的早期诊断11-12
• 1.1.2 PET显像原理12-14
• 1.1.3 PET显像的应用14-15
• 1.1.4 PET显像剂15-18
• 1.2 弗林酶与肿瘤18-22
• 1.2.1 Furin简介18-20
• 1.2.2 Furin的生物学功能20-21
• 1.2.3 Furin与肿瘤21
• 1.2.4 Furin抑制剂用于肿瘤治疗21-22
• 1.3 纳米技术用于肿瘤诊断22-24
• 1.3.1 纳米材料概述22
• 1.3.2 纳米材料在肿瘤治疗和诊断方面的应用22-24
• 1.4 本论文立题依据、化合物设计及主要研究内容24-31
• 1.4.1 立项依据24-28
• 1.4.2 本论文新型PET探针的设计28-29
• 1.4.3 研究内容29-31
• 第二章 冷化合物FBCKR的合成31-46
• 2.1 引言31-32
• 2.2 试剂与仪器32-33
• 2.2.1 试剂32
• 2.2.2 仪器32-33
• 2.3 化合物FBCKR的合成33-36
• 2.3.1 Ac-Arg-Val-Arg-Arg-Cys(St Bu)-Lys-OH（肽链A）合成33-34
• 2.3.2 CKR的合成34-35
• 2.3.3 SFB的合成35
• 2.3.4 FBCKR的合成35-36
• 2.4 结果与讨论36-45
• 2.4.1 肽链A的合成36-40
• 2.4.2 反应前体CKR、冷化合物FBCKR的合成及结构表征40-44
• 2.4.3 SFB晶体结构表征44-45
• 2.5 本章小结45-46
• 第三章 体外纳米粒子制备以及纳米表征46-51
• 3.1 引言46
• 3.2 试剂与仪器46-47
• 3.2.1 试剂46
• 3.2.2 仪器46-47
• 3.3 实验部分47
• 3.3.1 Furin酶控体外纳米粒子制备47
• 3.3.2 纳米结构表征47
• 3.4 结果与讨论47-50
• 3.4.1 纳米粒子制备及HPLC解析47-49
• 3.4.2 纳米结构表征49-50
• 3.5 本章小结50-51
• 第四章 ~(18)F-FBCKR的合成51-76
• 4.1 引言51-52
• 4.2 试剂与仪器52-53
• 4.2.1 试剂52
• 4.2.2 仪器52-53
• 4.3 合成过程53-60
• 4.3.1 ~(18)F-FDG合成53-56
• 4.3.2 ~(18)F-SFB合成56-58
• 4.3.3 ~(18)F-FBCKR合成58-60
• 4.4 ~(18)F-FBCKR的质检及稳定性研究60-61
• 4.4.1 pH值测定60
• 4.4.2 氨基聚醚(K222)杂质含量测定60
• 4.4.3 放射性比活度测定60
• 4.4.4 放射化学纯度测定60-61
• 4.4.5 稳定性研究61
• 4.5 结果与讨论61-74
• 4.5.1 ~(18)F-FDG合成61-66
• 4.5.2 ~(18)F-SFB合成66
• 4.5.3 ~(18)F-FBCKR合成及合成条件选择66-67
• 4.5.4 ~(18)F-FBCKR的质检及稳定性研究结果67-74
• 4.6 本章小节74-76
• 第五章 ~(18)F-FBCKR和FBCKR的细胞显像和细胞摄取研究76-89
• 5.1 引言76
• 5.2 试剂与仪器76-77
• 5.2.1 试剂和细胞76
• 5.2.2 仪器76-77
• 5.3 细胞培养77
• 5.3.1 细胞复苏77
• 5.3.2 细胞传代77
• 5.4 细胞实验77-80
• 5.4.1 Western blot实验77-78
• 5.4.2 FBCKR细胞毒性测定78
• 5.4.3 FBCKR细胞显像78-79
• 5.4.4 FBCKR细胞纳米验证79
• 5.4.5 ~(18)F-FBCKR细胞摄取实验79
• 5.4.6 ~(18)F-FBCKR和FBCKR细胞洗脱实验79-80
• 5.5 结果与讨论80-87
• 5.5.1 Western blot实验结果80-82
• 5.5.2 FBCKR细胞毒性测定结果82-83
• 5.5.3 FBCKR细胞显像图及解析83-84
• 5.5.4 FBCKR细胞纳米验证84-85
• 5.5.5 ~(18)F-FBCKR细胞摄取实验结果85-86
• 5.5.6 ~(18)F-FBCKR和FBCKR细胞洗脱实验结果86-87
• 5.6 本章小结87-89
• 第六章 ~(18)F-FBCKR和FBCKR的裸鼠Micro-PET显像研究89-93
• 6.1 引言89
• 6.2 试剂与仪器89
• 6.2.1 动物和试剂89
• 6.2.2 仪器89
• 6.3 荷瘤裸鼠Micro-PET显像实验89-90
• 6.3.1 裸鼠MDA-MB-468肿瘤模型的建立89
• 6.3.2 荷瘤裸鼠Micro-PET显像89-90
• 6.4 结果与讨论90-92
• 6.4.1 裸鼠MDA-MB-468肿瘤模型的建立90
• 6.4.2 荷瘤裸鼠Micro-PET显像结果90-92
• 6.5 本章小结92-93
• 主要结论与展望93-94
• 主要结论93-94
• 展望94
• 本论文创新点94-95
• 致谢95-96
• 参考文献96-102
• 附录: 作者在攻读博士学位期间发表的论文102

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