脂肪间充质干细胞治疗大鼠早期放射性肺纤维化的实验研究

发布时间：2017-09-20 05:07

  本文关键词：脂肪间充质干细胞治疗大鼠早期放射性肺纤维化的实验研究

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【摘要】：放射性肺纤维化（radiation-induced lung fibrosis，RILF）是胸部肿瘤患者接受放疗后最常见的并发症，肺纤维化不可逆转，可导致呼吸衰竭，甚至死亡。RILF由射线引起的早期间质性肺炎逐渐过渡发展为后期纤维化损伤的过程，目前临床上仍缺乏治疗RILF有效方法。Ad-MSC是干细胞家族的成员，具有多向分化潜能，可诱导分化为脂肪、成骨及肺上皮等多种组织细胞，并有免疫调控的作用，已用于多种组织器官的损伤修复。与其他来源干细胞相比，Ad-MSC来源广泛，可满足临床反复及多次的需求，且易于自体移植，无伦理道德争议。已有研究证实，骨髓MSC对多种急性肺损伤有良好的修复作用。目前尚未见有关Ad-MSC与RILF的研究报道，研究Ad-MSC修复RILF具有重要的临床意义。因此，本研究通过尾静脉移植Ad-MSC治疗SD大鼠RILF模型，观察疗效并探讨其作用机制，为指导临床Ad-MSC治疗RILF提供实验依据。本研究分为3部分： 1.大鼠早期放射性肺纤维化模型的建立及评价 本部分研究主要探索肺损伤程度与辐射剂量之间的关系，筛选出最佳的造模剂量，为下一步研究Ad-MSC治疗RILF提供了实验基础。RILF与动物品系、照射剂量、照射部位及射线种类等因素有关，其中，射线剂量的选择尤为关键。本部分以SD大鼠为研究对象，单次大剂量X射线照射大鼠右侧胸腔，设置4个剂量梯度：7.5Gy、15Gy、22.5Gy和30Gy，并于照射后的第28d对入组大鼠的一般状态、生存状态及肺组织病理HE和Masson染色等进行分析。结果发现：接受7.5Gy组大鼠在照射后28d存活率较高（93.33%），其肺组织病理损伤较轻微，RILI的疾病特征不明显；然而，30Gy组大鼠在照射后10d内全部死亡；15Gy和22.5Gy在照射后28d内大鼠存活率分别为66.67%和26.67%，并出现典型的肺组织损伤变化，主要包括肺泡结构破坏，肺间质水肿，肺泡壁明显增厚，肺间质内散在大量蓝色胶原纤维，肺泡腔变小，支气管及血管周围大量炎性细胞浸润，此病理变化符合RILF的疾病特征。虽然22.5Gy剂量能在较短时间内成功建立大鼠RILF模型，但此剂量下大鼠存活率低，不适合本实验后续所需的大数量的模型要求。以上结果表明肺损伤程度与辐射剂量呈线性关系，考虑到模型数量与质量的需求，我们采用15Gy剂量制作RILF大鼠模型，该剂量能在较短时间内成功模拟典型的肺纤维化特征，保证模型的成功率和生存率，为后续研究Ad-MSC治疗RILF提供了保证。 2.脂肪间充质干细胞生物学特性体外鉴定 在Ad-MSC的临床应用中，获得足够数量的高活性与高纯度Ad-MSC至关重要。本研究采用密度梯度离心技术结合贴壁法分离培养大鼠Ad-MSC，并对其生物学特性进行鉴定，，为Ad-MSC作为理想种子细胞在临床中的应用提供依据。本部分以3日龄雌性SD大鼠为研究对象，无菌状态下取双侧腹股沟处脂肪组织，分离培养Ad-MSC，观察细胞生长状态；应用流式细胞仪检测细胞表面标志；诱导分化培养体系鉴定Ad-MSC向成脂、成骨及成软骨分化的能力。结果显示：①A d-MSC均贴壁生长，呈成纤维细胞样，具有MSC的典型形态；②细胞表面表达CD29和CD44典型干细胞表面抗原，不表达CD11和CD45等造血和内皮细胞标志；③Ad-MSC在诱导分化培养体系中可向成骨、软骨和脂肪细胞分化。实验结果表明了此研究中所分离培养的Ad-MSC是均一纯度较高的细胞群，并具有自我更新能力和多向分化潜能，符合国际上对MSC的界定标准，满足进一步实验的要求。 3.脂肪间充质干细胞治疗大鼠早期放射性肺纤维化的实验研究 在前两部分研究中，先通过评估射线诱导的肺损伤与照射剂量之间的关系，筛选出最佳模型剂量15Gy，采用密度梯度离心技术结合贴壁法成功分离培养出高纯度高活性的Ad-MSC。在本部分研究中，我们采用15Gy X射线照射SD大鼠建立RILF模型，分离并传代大鼠Ad-MSC至P3代后，经尾静脉移植到RILF大鼠模型，并在不同时间点评估RILF大鼠生存率与肺组织病理情况，从炎症因子水平、纤维化因子水平、肺组织细胞凋亡水平及上皮细胞分化修复等方面探讨了Ad-MSC对急性RILF治疗效果及作用机制。结果显示：①Ad-MSC治疗组大鼠在受照后28d的生存率较单纯照射组显著提高（P0.05）；②Ad-MSC治疗组肺组织病理明显减轻，肺泡结构基本正常保存，仅有少量炎性细胞浸润，肺泡壁无明显增厚，肺间质内仅散在少量蓝色胶原纤维，与单纯照射组相比有显著性差异（P0.01）；③Ad-MSC显著抑制外周血促炎因子TNF-α、IL-1和IL-6表达，并提高抗炎因子IL-10表达来减轻RILI大鼠体内的炎症反应；④Ad-MSC下调肺组织促纤维化因子TGF-β1、α-SMA和Col1al的表达，上调HGF的表达来抑制纤维化反应的发生；⑤Ad-MSC下调促凋亡蛋白Bax和caspase-3表达，上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达来抵抗RILF肺组织细胞的凋亡，从而维持肺泡结构完整。⑥Ad-MSC于移植后第7d在受照射肺组织中表达SP-C，Ad-MSC可直接分化成Ⅱ型肺泡上皮细胞，具有修复肺泡上皮的能力。 综上所述，Ad-MSC明显提高了RILF模型大鼠的生存率，显著减轻大鼠肺组织损伤，作用机制主要与Ad-MSC的抗炎、抗纤维化、抗凋亡及直接分化成肺上皮细胞的能力密切相关。
【关键词】：脂肪间充质干细胞 干细胞 放射性肺纤维化 细胞移植
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.55
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-14
• 第1章 绪论14-16
• 第2章 文献综述16-26
• 2.1 RILF16-18
• 2.1.1 RILF 概述16
• 2.1.2 RILF 发生机制16-17
• 2.1.3 RILF 治疗现状17-18
• 2.2 间充质干细胞18-21
• 2.2.1 间充质干细胞概述18
• 2.2.2 间充质干细胞生物学特性18-20
• 2.2.3 间充质干细胞临床应用现状20
• 2.2.4 脂肪间充质干细胞临床应用优势20-21
• 2.3 间充质干细胞修复早期肺纤维化21-24
• 2.3.1 间充质干细胞修复早期肺纤维化机制21-23
• 2.3.2 间充质干细胞修复肺纤维化的研究现状23-24
• 2.4 立题依据24-26
• 第3章 大鼠早期放射性肺纤维化模型的建立及评价26-36
• 3.1 引言26
• 3.2 材料与方法26-30
• 3.2.1 实验材料26-27
• 3.2.2 实验方法27-30
• 3.3 实验结果30-33
• 3.3.1 照射后大鼠生存状态分析30-31
• 3.3.2 肺脏大体标本结果31-32
• 3.3.3 病理组织学改变32-33
• 3.4 讨论33-34
• 3.5 小结34-36
• 第4章 脂肪间充质干细胞生物学特性体外鉴定36-42
• 4.1 引言36
• 4.2 材料与方法36-38
• 4.2.1 实验材料36-37
• 4.2.2 实验方法37-38
• 4.3 结果38-40
• 4.3.1 Ad-MSC 体外培养的形态观察38-39
• 4.3.2 Ad-MSC 诱导分化能力39
• 4.3.3 Ad-MSC 表型鉴定39-40
• 4.4 讨论40-41
• 4.5 小结41-42
• 第5章 脂肪间充质干细胞治疗大鼠早期放射性肺纤维化实验研究2942-72
• 5.1 引言42
• 5.2 材料与方法42-55
• 5.2.1 实验材料42-46
• 5.2.2 实验方法46-55
• 5.3 结果55-67
• 5.3.1 脂肪间充质干细胞鉴定55
• 5.3.2 大鼠生存状态分析55-56
• 5.3.3 Ad-MSC 趋化能力鉴定56-58
• 5.3.4 肺组织病理学观察58-60
• 5.3.5 外周血炎症细胞因子含量变化60-61
• 5.3.6 外周血抗炎症细胞因子 IL-10 含量变化61
• 5.3.7 纤维化因子含量变化61-64
• 5.3.8 肺组织凋亡分析64-66
• 5.3.9 HGF 含量检测66
• 5.3.10 Ad-MSC 分化为Ⅱ型肺上皮细胞66-67
• 5.4 讨论67-71
• 5.5 小结71-72
• 第6章 全文结论72-74
• 参考文献74-86
• 作者简介及攻读博士学位期间发表的学术论文86-88
• 致谢88

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 蔡红兵,罗荣城;放射性肺损伤的中医药防治方法探讨[J];第一军医大学学报;2003年09期

2 房丽;荣绍元;王红阳;刘卫东;;地塞米松防治急性放射性肺损伤疗效观察[J];山东医药;2009年04期

本文编号：886068