卵巢特异性启动子OSP-2在体内体外对卵巢及卵巢癌示踪的研究
本文关键词：卵巢特异性启动子OSP-2在体内体外对卵巢及卵巢癌示踪的研究，，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：目的:应用OSP-2调控绿色荧光蛋白(GFP)特异性地在卵巢癌细胞表达,并结合活体生物荧光成像技术在裸鼠模型上对人卵巢癌细胞进行示踪,为临床卵巢癌的早期诊断和监测复发提供新的思路,为下一步基因靶向治疗提供实验依据。方法:1.构建由卵巢特异性启动子调控的带GFP基因的重组腺病毒载体;腺病毒转染卵巢癌、卵巢细胞及其他正常细胞株,通过荧光显微镜观察病毒转染效率,实时荧光定量PCR检测OSP基因及GFP基因的表达效果;2.建立卵巢癌转移裸鼠动物模型;在人卵巢癌转移裸鼠动物模型中注入上述OSP启动的重组腺病毒载体,采用CMV腺病毒载体作为阳性对照组和NS作阴性对照,运用活体生物荧光技术对体内的人卵巢癌细胞进行显像;3.对人卵巢癌转移裸鼠动物模型中癌灶和各脏器、组织进行冰冻切片显微观察荧光、免疫组织化学观察GFP阳性表达及荧光定量PCR对GFP基因相对表达量的检测。结果:1.显微镜下观察绿色荧光表达情况:转染96h后,显微镜观察,卵巢癌细胞和卵巢细胞内可见绿色荧光表达,但细胞株间转染率有差异,其中卵巢癌(SKOV3细胞株)㧐仓鼠卵巢(CHO细胞株)㧐卵巢癌(OVCAR-3细胞株);正常细胞内(肝细胞LO-2、脐静脉上皮融合细胞EA.hy926及胃粘膜上皮细胞GES-1)均未见绿色荧光;2.细胞荧光定量PCR结果显示:胃粘膜上皮细胞和肝细胞中OSP-2的表达水平转染前后有差异(P0.05),与卵巢癌细胞株对比转染后GFP表达量显示对比有差异(P0.05),且正常细胞内的GFP扩增无效;3.裸鼠活体荧光成像结果示:OSP注射组和CMV注射组均未见明显荧光聚集区,处死后行组织荧光成像示:CMV注射组中肝脏和胃可见荧光光团集聚,OSP注射组仅卵巢癌瘤体可见荧光集聚;4.组织冰冻切片显微镜下观察荧光显示:CMV注射组各脏器组织均可见荧光,其中肝脏的荧光最强,OSP注射组仅瘤体及卵巢可见微弱荧光,NS注射组均未见荧光;5.组织GFP免疫组化显示:CMV注射组中肝脏、肺组织、胃组织、肠道、瘤体均可见GFP表达,其中肝脏表达最强;OSP注射组仅瘤体可见GFP表达;6.组织荧光定量PCR显示:CMV注射组与OSP注射组对比GFP有差异(P0.05),OSP注射组与NS组对比GFP表达显示组织有自发荧光,结果存在误差。结论:通过体外实验得出OSP-2仅在卵巢癌细胞和卵巢细胞内特异性启动目的基因GFP的表达,进一步的体内验证也证实了OSP-2的卵巢组织特异性启动功能,为下一步的卵巢癌分子生物诊断和靶向治疗提供了一定的前期基础。但是在实验过程中发现,OSP-2启动功能不能达到预期的理想,后期实验中课题组重组腺病毒载体时可以多个OSP-2重组或者和CMV启动子合用增强启动功能。
【关键词】：卵巢特异性启动子 活体荧光表达 功能验证
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.31
【目录】：
- 摘要3-5
- ABSTRACT5-10
- 中英文缩略词表10-11
- 第1章 引言11-14
- 第2章 材料与方法14-27
- 2.1 实验材料14
- 2.1.1 细胞来源14
- 2.1.2 动物来源14
- 2.1.3 病毒来源14
- 2.2 主要仪器和试剂14-17
- 2.2.1 主要仪器14-15
- 2.2.2 主要试剂15-16
- 2.2.3 试剂配置16-17
- 2.3 实验方法17-26
- 2.3.1 细胞培养17-19
- 2.3.2 细胞转染19-20
- 2.3.3 细胞/组织的总RNA提取、纯化及RNA纯度与浓度检测20-23
- 2.3.4 裸鼠体内实验23-25
- 2.3.5 冰冻切片荧光检测25
- 2.3.6 组织免疫组化25-26
- 2.4 统计分析26-27
- 第3章 结果27-46
- 3.1 细胞转染结果27
- 3.2 RNA质量控制27-28
- 3.2.1 大体观察结果27-28
- 3.2.2 紫外分光光度计扫描结果28
- 3.3 裸鼠实验结果28-38
- 3.3.1 成瘤28-29
- 3.3.2 活体荧光成像29-32
- 3.3.3 冰冻组织切片荧光32-35
- 3.3.4 免疫组化35-38
- 3.4 PCR结果38-46
- 3.4.1 细胞PCR结果38-41
- 3.4.2 组织PCR结果41-46
- 第4章 讨论46-52
- 4.1 卵巢癌的诊断和治疗46-47
- 4.2 组织特异性启动子47-48
- 4.3 OSP--卵巢特异性启动子48-49
- 4.4 体内外验证特异性启动子49-50
- 4.5 实验不足之处50-52
- 第5章 结论52-53
- 致谢53-54
- 参考文献54-58
- 攻读学位期间的研究成果58-59
- 综述59-66
- 参考文献64-66
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