探讨人卵巢组织玻璃化冻存及卵母细胞的获取
本文关键词：探讨人卵巢组织玻璃化冻存及卵母细胞的获取，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：目的:玻璃化冷冻是一种快速、简易、经济的冻存卵巢组织方法,对人类和动物卵巢组织冻存具有很大前景,由于卵巢组织不同于胚胎和卵母细胞,所以其冻存方法有很大改善空间。目前唯一可靠评价冷冻效果的是临床妊娠率和出生率,改善玻璃化冷冻方法的最好方式为针对冷冻方案中单因素逐步改进,本研究在仅改变一个参数的基础上,选择出最适合卵巢组织玻璃化冻存的冷冻保护剂浓度,并在此基础上获取未成熟卵母细胞行成熟培养,作为不宜行卵巢刺激及不可延误进一步治疗的女性保留生育力的最佳手段。材料与方法:收集40例2014年3月~9月因卵巢良性肿物行手术者,取其剥离的卵巢囊肿壁上残留卵巢组织共40片,利用患者手术切除的废弃组织进行研究。切割卵巢皮质前使用22号针头+5ml注射器吸取可见卵泡,将吸取液注入卵母细胞洗涤液GMOPS中,余各组卵巢组织切割成大小1mm×1mm×5mm的卵巢皮质块,各组随机取其中8块,按玻璃化冷冻液不同浓度随机分为4组,玻璃化冷冻组3组,另一组为对照组(新鲜组)。获取的未成熟卵母细胞置于含培养液的四孔皿中,放于37℃含5%CO2高湿度培养箱中培养24小时后,分离成熟卵母细胞行玻璃化冷冻存于液氮中。新鲜对照组的卵巢皮质块行10%中性福尔马林固定待用。3组玻璃化冷冻组皮质块以筛网为载体分别经3种不同浓度冷冻液处理后放入液氮中保存一周后解冻,经10%中性福尔马林固定后行HE染色及免疫组化标记,分析比较3组玻璃化冷冻组与新鲜对照组冻融前后卵泡形态学变化、细胞增殖及凋亡程度,并判定计数成熟卵母细胞数量。结果:1.卵巢组织形态学评估及计数各级卵泡数量CPA1与对照组比较各级卵泡数量,差异无统计学意义(P0.05)。3组玻璃化冷冻组,无论哪种冷冻方法复苏后对卵巢组织始基卵泡影响均不明显,但可见卵巢组织内部分间质细胞排列紊乱、疏松甚至出现分离。2.免疫组化结果比较计数每10个高倍视野阳性细胞数,玻璃化冷冻组与对照组比较,仅CPA1组卵巢组织中各级卵泡卵母细胞及颗粒细胞中Ki-67表达与对照组比较,差异无统计学意义(P0.05)。3.Tunel细胞凋亡检测结果玻璃化冷冻组与对照组始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡内均未见凋亡细胞,仅部分间质细胞核、血管内皮细胞核内可见凋亡颗粒。4.玻璃化冻存卵母细胞数量未成熟卵泡来自于12例病人卵巢皮质,成熟培养后其平均成熟率为82.7%,共20枚成熟卵母细胞经玻璃化冻存。结论:1.采用DMSO与EG低浓度配伍组无论是光镜下卵泡形态,细胞增殖活性还是细胞凋亡程度均与对照组无统计学差异,明显优于高浓度组及PROH联合EG组。2.对于不宜行卵巢刺激及不可延误进一步治疗的女性,玻璃化冻存卵巢组织块及抽取不成熟卵母细胞行体外成熟培养可作为该类患者保留生育能力的最佳手段。3.筛网作为新型冷冻载体冻存卵巢组织,推动了卵巢组织玻璃化冷冻的新进展。
【关键词】：卵巢组织 玻璃化冷冻 冷冻保护剂 IVM Ki-67 细胞凋亡
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R714.8
【目录】：
- 中文摘要4-6
- Abstract6-10
- 缩略语10-11
- 前言11-13
- 研究现状、成果11
- 研究目的、方法11-13
- 对象和方法13-19
- 1 实验对象13-15
- 1.1 组织来源及处理13
- 1.2 主要试剂13-14
- 1.3 主要设备及耗材14-15
- 1.4 冷冻保护液的配备15
- 1.5 卵巢组织及卵母细胞冷冻复苏液的配备15
- 2 实验方法15-18
- 2.1 未成熟卵母细胞成熟培养及玻璃化冻存15-16
- 2.1.1 未成熟卵母细胞成熟培养15-16
- 2.1.2 成熟卵母细胞玻璃化冻存16
- 2.2 分组16
- 2.3 方法16
- 2.3.1 对照组16
- 2.3.2 玻璃化冷冻组16
- 2.3.3 复苏方法16
- 2.4 人卵巢组织冷冻复苏效果判断16-18
- 2.4.1 卵巢组织结构分析16
- 2.4.2 卵母细胞成熟度判定16-17
- 2.4.3 细胞增殖活性检测17-18
- 2.4.4 细胞凋亡检测18
- 3 统计学处理18-19
- 结果19-24
- 1 对照组与玻璃化冷冻组HE染色结果比较19-20
- 2 对照组与玻璃化冷冻组免疫组化结果比较20-21
- 3 对照组与玻璃化冷冻组Tunel细胞凋亡检测结果21-22
- 4 玻璃化冻存卵母细胞数量22-24
- 讨论24-30
- 1 传统程序化冷冻方法和玻璃化冷冻24
- 2 卵巢玻璃化冷冻的影响因素24-27
- 2.1 玻璃化冷冻液配伍及浓度25-26
- 2.2 CPA温度26
- 2.3 逐步添加溶液26
- 2.4 卵巢组织块大小26-27
- 2.5 玻璃化冷冻载体27
- 2.6 专业的技术27
- 3 冻融后效果检测27-30
- 3.1 卵巢组织结构分析27-28
- 3.2 细胞增殖活性28
- 3.3 细胞凋亡28
- 3.4 未成熟卵母细胞成熟培养28-30
- 结论30-31
- 参考文献31-35
- 发表论文和参加科研情况说明35-36
- 综述 女性肿瘤患者生育力的保存36-46
- 综述参考文献42-46
- 致谢46-47
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