研磨法制备的胎盘源性微囊泡形态特征鉴定和部分功能活性检测

发布时间：2020-11-17 05:41

　　 目的:目前已有研究证实与正常孕妇相比,子痫前期孕妇外周血胎盘源性微囊泡(placental-derived microvesicles,pcMVs)水平明显升高。同时文献研究采用胎盘绒毛组织机械震荡、绒毛组织体外培养和胎盘子叶灌注三种不同方法制备胎盘源性微囊泡进行体外实验,发现胎盘源性微囊泡可能与内皮细胞功能障碍、炎症反应和凝血纤溶失衡有关。本实验在上述三种制备方法的基础上,以及参考脑源性微囊泡的制备方法,采用冻存绒毛组织研磨法制备胎盘源性微囊泡,并且与重度子痫前期孕妇外周血微囊泡进行对比鉴定,观察两者在形态以及功能活性的差异。探讨建立一个改良型制备方法,利于体外实验进行胎盘源性微囊泡与子痫前期发病机制相关性研究。方法:1)正常孕妇剖宫产时取胎盘组织,采用免疫组织化学法鉴定选取的样本组织为绒毛组织;2)胎盘绒毛组织采用组织匀浆器研磨分步离心的方法体外制备pcMVs,同时抽取重度子痫前期孕妇外周血分步离心的方法体外制备外周血微囊泡;3)用透射电镜、流式细胞仪和Nanosight方法鉴定所得的研磨法pcMVs和外周血微囊泡的形态学及表型;4)用半自动凝血仪TS6000,体外检测研磨法pcMVs和外周血微囊泡两组的凝血酶原时间(Prothrombin time,PT),比较促凝活性;5)应用Transwell小室系统检测研磨法pcMVs和外周血微囊泡穿透人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)的能力;6)应用离子电导显微镜观察研磨法pcMVs和外周血微囊泡两组分别对HUVEC之间的细胞连接以及细胞形态的影响。结果:1)免疫组织化学法结果显示胎盘组织能表达合体滋养细胞的特异性标记物---胎盘碱性磷酸酶,证实选取部位的组织为绒毛组织;2)胎盘绒毛组织研磨制备的pcMVs和子痫前期外周血离心制备的微囊泡在透射电镜下观察均具有膜结构;3)流式细胞术结果显示胎盘研磨法制备的pcMVs能表达大量的合体滋养细胞特异性标记物,而基本不表达血小板、红细胞、白细胞和内皮细胞的标志物。子痫前期孕妇外周血微囊泡也能表达合体滋养细胞特异性标记物,少部分表达血小板、红细胞、白细胞标志物和基本不表达内皮细胞的标志物;4)Nanosight结果显示两组制备的微囊泡的粒径范围大都在100-500nm之间;5)促凝实验中,与PBS溶剂对照组相比,胎盘研磨法pcMVs和子痫前期孕妇外周血微囊泡组的凝血酶原时间(Prothrombin time,PT)均明显缩短(p0.001),显示两组制备的微囊泡均具有促凝活性,而与外周血微囊泡组相比,胎盘研磨法pcMVs的PT值明显缩短(p0.001);6)两组微囊泡均能穿透HUVEC,并且研磨法pcMVs穿透能力高于外周血微囊泡;7)胎盘pcMVs能破坏HUVEC之间的连接,增大细胞间的缝隙,并且引起内皮细胞形态改变,细胞高度明显增加;外周血微囊泡也能破坏细胞连接,使内皮细胞形态发生改变。结论:1)通过胎盘绒毛组织研磨分步离心的方法在体外成功大量制备了微囊泡,具有完整的膜结构、能高表达滋养细胞特异性标记物并且直径大小范围符合微囊泡定义,并且与子痫前期外周血微囊泡形态特征相符合;2)体外利用研磨法制备的胎盘pcMVs具有促凝活性,并且会引起内皮细胞通透性增加,损害内皮细胞等功能活性,为后续研究pcMVs与子痫前期发病机制相关性提供了充足的原料。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R714.244
【部分图文】：

(1) 将离心所得研磨法 pcMVs 和外周血微囊泡的重悬液分别稀释 50 倍和 20 倍充分混匀后使用 1ml 无菌注射器导入纳米颗粒分析仪中，在屏幕上观察布朗运动。(2) 之后可在纳米颗粒分析仪的屏幕上观察到微囊泡的布朗运动，然后对其结果直接进行分析。1.1.6.2 实验原理NanoSight 纳米颗粒分析仪主要运用光散射的原理和微囊泡的布朗运动，反映所测样本液体中微囊泡。当激光束照射到微囊泡表面时，就会使激光束发生散射，然后通过显微镜清晰地观察到囊泡，并且可用显微镜记录下微囊泡的布朗运动，进而分析所测微囊泡样本液的粒径分布曲线。1.2 结果1.2.1 免疫组织化学法鉴定选取样本组织选取样本组织的阳性组能大量表达 PLAP（图 1A），证明选取的组织包含有合体滋养细胞；PBS 溶剂空白对照组则不表达（图 1B）。

于 0.1μm 的区域，用来确定微囊泡的大小以及位置(图 2.1A)。其中图 2.1.B 所示 P1 区域即为微囊泡的区域，横纵坐标 FSC 和 SSC 均采用对数刻度。选定 P1门，进入下一个散点图（图 2.1C），横坐标为 PE 荧光素结合的 PS 的标记 AnnexinV，纵坐标为 FITC 荧光素结合的合体滋养细胞的标记物 PLAP，横坐标和纵坐标均采用对数刻度。最后应用购买的 AccuCount Ultra-Rainbow FluorescebntParticles（浓度 beads），根据浓度浓度 beads 在 FSC/PerCP 散点图（图 2.1D）生成的图形，来圈定浓度微粒的位置，根据公式（收集微囊泡总数*500）/（收集浓度 beads 数*样本体积）=样品微囊泡的浓度（个/μl），计算所测微囊泡的浓度。胎盘研磨法 pcMVs 测定的流式管中，根据 FITC-PLAP 的同型对照和PE-Annexin V+EDTA 对照管（图 2.2B）划定 FITC-PLAP 阳性的区域（Q1-1+Q2-1象限）和 PE-Annexin V 阳性区域（Q4-1+Q2-1 象限），图 2.2C 中 Q2-1 象限则为FITC-PLAP 和 PE-Annexin V 双阳性区域。子痫前期孕妇外周血微囊泡测定的流式管中，图 2.2Ⅱ为 PLAP 的同型对照和 PE-Annexin V+EDTA 对照管，图 2.2C中 Q2-1 象限也是 FITC-PLAP 和 PE-Annexin V 双阳性区域。

图 1.2.2 A 和Ⅰ：胎盘研磨法 pcMVs 组和子痫前期孕妇外周血微囊泡组的阴性对照管；B 和Ⅱ：胎盘研磨法 pcMVs 和子痫前期孕妇外周血微囊泡FITC-PLAP 的同型对照；C 和Ⅲ：胎盘研磨法 pcMVs 和子痫前期孕妇外周血微囊泡 FITC-PLAP/PE-Annexin V 阳性区域 Q2-1按照 P2 区域， 1g 胎盘绒毛组织研磨离心 1ml PBS 重悬然后稀释 10 倍，按照低速 60s 上机所得的微囊泡浓度为 2-4*106个/μl，而 20ml 子痫前期孕妇外周血超离 200μl 重悬后，同样按照低速 60s 上机所测得微囊泡的浓度为 1-4*106个/μl。我们对比研磨法 pcMVs 组和外周血微囊泡组 FITC-PLAP 阳性率，结果显示胎盘研磨法 pcMVs 的 FITC-PLAP 阳性率为 88.6%±2.4%，外周血微囊泡FITC-PLAP 阳性率为 57.3%±2.1%，胎盘研磨法 pcMVs 组和外周血微囊泡组PE-Annexin V 阳性率分别为 4.2%±0.8%、 3.3%±1.2%。1.2.2.2 研磨法 pcMVs 和外周血微囊泡两组中血小板、红细胞、白细胞、内皮细
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本文编号：2887150