耐药卵巢癌细胞的体外筛选及核酸适配体的初步应用
发布时间：2020-12-04 00:58
核酸适配体（aptamer）是通过体外筛选技术,即指数富集的配体系统进化技术（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）得到的单链DNA或RNA。核酸适配体被称为“化学抗体”,有着与蛋白抗体相同的识别机制,并且,较蛋白抗体具有一定的优势:可直接通过化学合成并能根据要求对其修饰;亲和力高,结合解离常数甚至可达到纳摩尔级;结构稳定,便于保存等。利用活的肿瘤细胞为靶标的cell-SELEX技术,能够在靶标分子未知的前提下,筛选得到识别肿瘤细胞的核酸适配体,直接用于肿瘤的诊断及治疗。本论文利用cell-SELEX技术筛选靶向肿瘤细胞的核酸适配体,对核酸适配体进行结构分析和性质表征,并尝试利用这些核酸适配体开发肿瘤的诊断和治疗新方法,具体研究如下:耐药型的卵巢癌细胞的筛选及表征:以紫杉醇耐受的卵巢癌细胞A2780T作为筛选的靶细胞,野生型卵巢癌细胞A2780作为反筛细胞,筛选出选择性识别A2780T细胞的核酸适配体HF3和HA5。对其进行序列优化及表征,得到具有高亲和力的核酸适配体HF3-58和HA5-68,进...
【文章来源】：湘潭大学湖南省
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
SELEX基本筛选过程[9]
?＼?ｌａｓ：?ＳＥＬＥＸ??＼一?．★＊．??Ｃｌｏｎｉｎｇ?ａｎｄ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ??图１．１?ＳＥＬＥＸ基本筛选过程［９］??１．３．２?ＳＥＬＥＸ技术的分类??１．３．２．１传统筛选方法??利用传统的ＳＥＬＥＸ技术，筛选得到核酸适配体需要几周甚至是一个月的时??间［９］，基本原理见图１．２。通过化学合成的寡核苷酸文库用于核酸适配体的筛选，??此文库中的寡核苷酸一般由中间随机序列和两端固定的引物序列构成。传统的??ＳＥＬＥＸ筛选方法中的筛选步骤取决于筛选的核酸适配体的类型。对于ＤＮＡ型的??核酸适配体，通过化学合成的ＤＮＡ文库直接与靶标分子孵育，然后将与靶标分??子不结合的序列洗掉，再分离靶分子与结合的ＤＮＡ，经过ＰＣＲ将分离出的结合??的ＤＮＡ序列进行扩增再进行下一轮的筛选。通过一系列筛选得到潜在的核酸适??配体，进一步通过多种研究方法确定其序列及其动力学。对于ＲＮＡ型的核酸适??配体，增加了体外转录和反转录的步骤，将一个ＤＮＡ文库先要转录成ＲＮＡ文??库，筛选过程与ＤＮＡ型的一致，结合后的ＲＮＡ序列分离出来之后将其反转录??成ＤＮＡ序列
图１．３毛细管电泳ＳＥＬＥＸ技术示意图［９］??１．３．２．３基于磁珠的ＳＥＬＥＸ技术??利用磁珠固定靶分子的ＳＥＬＥＸ技术（图１．４）在１９９７年被提出。该方法是??将靶分子固定在磁珠上与寡核苷酸的文库进行孵育，通过磁力分离器将靶蛋白与??核酸适配体的结合混合物从不结合的寡核苷酸分离出来，然后通过荧光显微镜定??性与靶蛋白结合的核酸适配体，利用流式细胞术进行定量。２００５年一种更方便??更容易的ＦｌｕＭａｇ－ＳＥＬＥＸ［３８］方法被提出，ｎｕＭａｇ?ＳＥＬＥＸ技术的原理是基于目标??磁珠固定化：第一轮选拔后，单链ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增并标记荧光素修饰引物??量化下一步的筛选的核酸适配体；然后将获得的寡核苷酸克隆并测序。富集后的??核酸适配体的解离常数可以通过荧光测定。使用此方法得到了链和青霉素［３８］，异??丁苯丙酸［３９］和多氯联苯＿的核酸适配体。Ｃａｐｔｕｒｅ－ＳＥＬＥＸ是Ｓｔｏｌｔｅｎｂｕｒｇ等人在??２０１２年提出的基于ＦｌｕＭａｇ?ＳＥＬＥＸ的新方法。其区别在于将固定靶分子替代为??磁珠固定筛选ＤＮＡ文库，这样的修改是针对筛选不能被固定的小分子，如同??ＦｌｕＭａｇＳＥＬＥＸ筛选一样每轮筛选后进行荧光标记使得可通过荧光定量。基于该??方法筛选得到的核酸适配体的靶分子有卡那霉素
本文编号：2896754
【文章来源】：湘潭大学湖南省
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
SELEX基本筛选过程[9]
?＼?ｌａｓ：?ＳＥＬＥＸ??＼一?．★＊．??Ｃｌｏｎｉｎｇ?ａｎｄ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ??图１．１?ＳＥＬＥＸ基本筛选过程［９］??１．３．２?ＳＥＬＥＸ技术的分类??１．３．２．１传统筛选方法??利用传统的ＳＥＬＥＸ技术，筛选得到核酸适配体需要几周甚至是一个月的时??间［９］，基本原理见图１．２。通过化学合成的寡核苷酸文库用于核酸适配体的筛选，??此文库中的寡核苷酸一般由中间随机序列和两端固定的引物序列构成。传统的??ＳＥＬＥＸ筛选方法中的筛选步骤取决于筛选的核酸适配体的类型。对于ＤＮＡ型的??核酸适配体，通过化学合成的ＤＮＡ文库直接与靶标分子孵育，然后将与靶标分??子不结合的序列洗掉，再分离靶分子与结合的ＤＮＡ，经过ＰＣＲ将分离出的结合??的ＤＮＡ序列进行扩增再进行下一轮的筛选。通过一系列筛选得到潜在的核酸适??配体，进一步通过多种研究方法确定其序列及其动力学。对于ＲＮＡ型的核酸适??配体，增加了体外转录和反转录的步骤，将一个ＤＮＡ文库先要转录成ＲＮＡ文??库，筛选过程与ＤＮＡ型的一致，结合后的ＲＮＡ序列分离出来之后将其反转录??成ＤＮＡ序列
图１．３毛细管电泳ＳＥＬＥＸ技术示意图［９］??１．３．２．３基于磁珠的ＳＥＬＥＸ技术??利用磁珠固定靶分子的ＳＥＬＥＸ技术（图１．４）在１９９７年被提出。该方法是??将靶分子固定在磁珠上与寡核苷酸的文库进行孵育，通过磁力分离器将靶蛋白与??核酸适配体的结合混合物从不结合的寡核苷酸分离出来，然后通过荧光显微镜定??性与靶蛋白结合的核酸适配体，利用流式细胞术进行定量。２００５年一种更方便??更容易的ＦｌｕＭａｇ－ＳＥＬＥＸ［３８］方法被提出，ｎｕＭａｇ?ＳＥＬＥＸ技术的原理是基于目标??磁珠固定化：第一轮选拔后，单链ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增并标记荧光素修饰引物??量化下一步的筛选的核酸适配体；然后将获得的寡核苷酸克隆并测序。富集后的??核酸适配体的解离常数可以通过荧光测定。使用此方法得到了链和青霉素［３８］，异??丁苯丙酸［３９］和多氯联苯＿的核酸适配体。Ｃａｐｔｕｒｅ－ＳＥＬＥＸ是Ｓｔｏｌｔｅｎｂｕｒｇ等人在??２０１２年提出的基于ＦｌｕＭａｇ?ＳＥＬＥＸ的新方法。其区别在于将固定靶分子替代为??磁珠固定筛选ＤＮＡ文库，这样的修改是针对筛选不能被固定的小分子，如同??ＦｌｕＭａｇＳＥＬＥＸ筛选一样每轮筛选后进行荧光标记使得可通过荧光定量。基于该??方法筛选得到的核酸适配体的靶分子有卡那霉素
本文编号：2896754
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