以MMP-2为靶点的FRET探针的制备及其在宫颈癌检测中的应用

发布时间：2017-04-23 11:05

  本文关键词：以MMP-2为靶点的FRET探针的制备及其在宫颈癌检测中的应用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景宫颈癌(cervical carcinoma)是常见的妇科恶性肿瘤之一,全世界每年约有30万女性死于宫颈癌。从宫颈上皮内瘤变到宫颈浸润癌约10~20年,是早期防治宫颈癌的重要阶段。目前,宫颈癌的筛查方法很多,但均存在诸多缺陷。探索灵敏度高、特异性强的宫颈癌检测和诊断方法(如价格低廉、检测方便的荧光探针等)成为研究的热点。基质金属蛋白酶-2(matrix-metalloproteinase,MMP-2)在正常宫颈上皮细胞中不表达或低表达,而在宫颈上皮内瘤变和宫颈浸润癌中高表达,可用于宫颈良、恶性病变的鉴别诊断,也为探索以MMP-2为靶点的宫颈癌检测方法奠定了基础。现有的检测MMP-2的方法均无法在活细胞或活体中进行检测。以MMP-2为靶点制备的Cd Te量子点探针由于毒性较大等原因而在实际应用中受到限制。目的本研究将荧光基团[7-(二乙胺基)香豆素-3-羧酸]通过能被MMP-2切割的多肽链(GPLGVRGKGG)连接到荧光淬灭基团{4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸N-丁二酰亚胺酯},构建以MMP-2为靶点的荧光共振能量转移探针。研究其用于检测宫颈癌细胞和宫颈癌荷瘤小鼠活体成像的可行性,为其用于宫颈癌的检测提供科学依据。方法1.制备荧光基团香豆酸琥珀酰亚胺活性酯。2.通过能被MMP-2切割的多肽链(GPLGVRGKGG)将荧光基团[7-(二乙胺基)香豆素-3-羧酸]连接到{4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸N-丁二酰亚胺酯},制备以MMP-2为靶点的荧光共振能量转移探针。3.测试MMP-2、MMP-1和其他生物学相关物质对探针的荧光响应。4.培养宫颈癌CaSki、SiHa、C33-A和HeLa细胞,应用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-PCR,RT-PCR),实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,q PCR)及Western blotting方法检测MMP-2 m RNA和蛋白在4种不同宫颈癌细胞系中表达情况。5.将以MMP-2为靶点的荧光探针与宫颈癌CaSki、SiHa、C33-A和HeLa细胞共孵育,通过共聚焦荧光显微镜观察探针对不同宫颈癌细胞的识别能力。6.构建宫颈癌SiHa和HeLa细胞荷瘤小鼠模型;以宫颈癌SiHa和HeLa细胞荷瘤小鼠为研究对象,分别通过尾静脉和瘤内注射将以MMP-2为靶点的荧光探针注射到小鼠体内,通过活体成像仪观察活体成像情况。结果1.制备了香豆酸琥珀酰亚胺活性酯,并通过核磁共振氢谱(1H nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum,1H NMR)、核磁共振碳谱(~(13)C nuclear magnetic resonance spectrum,~(13)C NMR)和电喷雾质谱(electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)表征。香豆酸琥珀酰亚胺活性酯的紫外-可见光谱最大吸收峰为445 nm。香豆酸琥珀酰亚胺活性酯为强烈的绿色荧光,荧光发射峰在480 nm处。为探针的合成奠定了基础。2.构建了以MMP-2为靶点的荧光共振能量转移探针并通过基质辅助激光解析离子化-飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF)和高效液相色谱法(high-pressure liquid chromatography,HPLC)表征。3.荧光响应实验结果显示:(1)随着时间的增加,以MMP-2为靶点的荧光探针在480 nm的荧光强度明显增强,增强了10倍左右并在2 h趋于平衡。(2)相关的生物学物质如MMP-1、K~+、Mg~(2+)、Na~+、Fe~(3+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)、Ca~(2+)、L-色氨酸(L-tryptophan,L-Trp)、L-丝氨酸(L-serine,L-Ser)、L-天冬氨酸(L-aspartic acid,L-Asp)、HCO_3~-、NO_3~-、ClO_4~-、F~-和Br~-对以MMP-2为靶点的荧光探针的荧光光谱没有显著的变化,荧光响应不明显。4.RT-PCR、qPCR、Western blotting结果均显示:MMP-2在4种宫颈癌细胞中的表达顺序是:CaSki细胞SiHa细胞C33-A细胞HeLa细胞(P0.05)。5.细胞成像结果显示:用以MMP-2为靶点的荧光探针对宫颈癌CaSki、SiHa、C33-A和HeLa细胞进行荧光识别,当以MMP-2为靶点的荧光探针和宫颈癌细胞孵育2 h之后,宫颈癌细胞都表现出绿色荧光且其荧光强度为CaSki细胞SiHa细胞C33-A细胞HeLa细胞。6.构建宫颈癌SiHa和HeLa细胞荷瘤小鼠模型。活体成像结果显示,分别将以MMP-2为靶点的荧光探针(1mM)通过尾静脉和瘤内注射到小鼠体内后,两种荷瘤小鼠的瘤体均呈现强烈的荧光,但宫颈癌SiHa细胞荷瘤小鼠瘤体的荧光强度大于宫颈癌HeLa细胞荷瘤小鼠瘤体的荧光强度。结论1.制备了基于香豆素荧光基团的靶向MMP-2荧光共振能量转移探针。2.该探针可用于宫颈癌活细胞成像和宫颈癌荷瘤小鼠体内成像。
【关键词】：宫颈癌 基质金属蛋白酶-2 荧光共振能量转移探针 活细胞成像 活体成像
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-12
• 前言12-14
• 1 材料与方法14-30
• 2 结果30-41
• 3 讨论41-44
• 4 结论44-45
• 参考文献45-50
• 综述：蛋白酶荧光探针在肿瘤检测方面的应用50-64
• 参考文献59-64
• 附录 英文缩略词64-65
• 攻读学位期间发表文章情况65-66
• 致谢66-67
• 个人简历67

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本文编号：322279