同源异形框基因PRX-2调控人表皮干细胞增殖的研究

发布时间：2017-04-23 13:09

  本文关键词：同源异形框基因PRX-2调控人表皮干细胞增殖的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的 孕中期胎儿的皮肤创伤后以再生方式进行修复,而成人皮肤创面以瘢痕方式愈合。既往研究发现,同源异形框基因PRX-2在胎儿和成人皮肤及创面修复过程中的表达存在显著差异。表皮干细胞(epidermal stem cells, ESCs)与正常皮肤更新生长和创面修复密切相关,在胎儿时期的ESCs主要分布在真皮乳头层,成人主要位于表皮基底层和毛囊隆突部,上述胎儿或成人皮肤ESCs主要分布的区域正是PRX-2基因阳性表达的位置。基于以上研究进展,可以推测PRX-2和ESCs之间以及与胎儿和成人皮肤创伤修复方式的不同存在某种关系。因此,本研究使用慢病毒载体介导的PRX-2基因过表达成人ESCs和慢病毒载体介导的siRNA沉默胎儿ESCs的PRX-2基因,改变胎儿ESCs和成人ESCs中PRX-2基因的表达,观察其细胞增殖的变化情况,从正、反两个方向研究PRX-2基因在人ESCs增殖中的作用,为从发育生物学角度进行创面再生修复机制的研究提供理论和方法学基础。方法1.采集水囊引产的健康孕20～28周龄胎儿背部的全层皮肤,成人皮肤主要来自在本院泌尿外科24小时内行包皮环切术的患者。Dispase酶分离表皮和真皮,胰酶消化法得到表皮细胞悬液,Ⅳ型胶原粘附法获得人ESCs,倒置相差显微镜下观察人表皮干细胞形态学变化,免疫荧光染色法/流式鉴定细胞的表面标志物β1整合素、K19、P63、K7和K10。2.CCK-8法检测胎儿ESCs和成人ESCs的增殖活性,实时定量PCR检测细胞中PRX-2基因的表达。取生长状态良好的第2代胎儿ESCs和成人ESCs,使用慢病毒载体介导的PRX-2基因过表达成人ESCs和慢病毒载体介导的siRNA沉默胎儿ESCs中的PRX-2基因。转染3-4天后,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况,接着应用Western blot;法检测病毒转染情况。确认导入目标基因后,采用CCK-8法绘制细胞生长曲线,检测胎儿ESCs和成人ESCs的增殖情况,流式细胞仪分析细胞周期。结果1.采用Ⅳ型胶原黏附法获得胎儿ESCs和成人ESCs,并进行体外培养,获得的两种细胞阳性表达ESCs的表面标志物。胎儿ESCs和成人ESCs的体积均较小,近乎圆形,但胎儿ESCs的体积较成人ESCs的体积更小,二者均呈典型的“铺路石样”和克隆性生长。透射电镜下观察发现胎儿ESCs和成人ESCs的细胞核均较大,核仁较明显,胞浆较少。综合以上结果确定分离得到的细胞是ESCs。2.胎儿ESCs的增殖速率显著快于成人ESCs,并且胎儿ESCs中PRX-2基因的表达高于成人ESCs;病毒转染后的ESCs在荧光显微镜下可观察到GFP的表达;Western blot检测结果显示,PRX-2基因过表达成人ESCs组的PRX-2蛋白表达上调,PRX-2基因沉默胎儿ESCs组的PRX-2蛋白表达下调。生长曲线结果显示,与成人ESCs寸照组相比,PRX-2基因过表达成人ESCs组的增殖速度显著增加;PRX-2基因沉默的胎儿ESCs组与胎儿ESCs对照组相比,其增殖速度显著降低。细胞周期结果表明,PRX-2基因过表达的成人ESCs组中处于增殖周期(S期)的细胞比例显著高于成人ESCs对照组;PRX-2基因沉默的胎儿ESCs组中处于增殖周期(S期)的细胞比例显著低于胎儿ESCs对照组。结论胎儿ESCs中PRX-2基因的表达高于成人ESCs,过表达PRX-2基因后ESCs的增殖能力显著增强。同源异型框基因PRX-2在皮肤再生愈合方面发挥重要作用。
【关键词】：胎儿 人表皮干细胞 增殖 PRX-2 基因转染
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R714.5
【目录】：

• 缩略词表6-8
• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 第一部分 胎儿和成人表皮干细胞的分离、提取和鉴定12-25
• 前言12-13
• 材料与方法13-17
• 实验结果17-21
• 讨论21-22
• 小结22-23
• 参考文献23-25
• 第二部分 PRX-2对人表皮干细胞增殖影响的研究25-40
• 前言25
• 材料与方法25-31
• 实验结果31-36
• 讨论36-37
• 小结37-38
• 参考文献38-40
• 文献综述40-50
• 参考文献46-50
• 攻读硕士学位期间发表的文章50-51
• 致谢51-52

【共引文献】

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本文编号：322438