沉默KDM5A基因对卵巢上皮癌顺铂耐药细胞SKOV3/DDP耐药性的影响

发布时间：2022-07-03 20:36

　　目的:探讨沉默KDM5A基因表达对卵巢上皮癌顺铂耐药细胞SKOV3/DDP耐药性的影响及其机制。方法:选择高表达KDM5A的SKOV3/DDP细胞,设计KDM5A基因靶向的发夹状shRNA,筛选出最佳shRNA沉默片段,构建携带有目的基因的重组慢病毒干扰载体并感染SKOV3/DDP细胞,通过嘌呤霉素筛选,RT-PCR和Western blot法验证,建立稳定干扰KDM5A表达的细胞株SKOV3/DDP-KDM5Ai。将实验分为3组,即KDM5A沉默组（SKOV3/DDP-KDM5Ai）、阴性对照组（SKOV3/DDP-NC）和空白对照组（SKOV3/DDP）,流式细胞仪检测细胞的周期比例及凋亡情况; CCK-8法检测细胞的IC₅₀;高效液相色谱分析法检测在不同质量浓度（7.5μg/ml和15μg/ml）顺铂作用48h后细胞内的药物浓度。RT-PCR技术和Western blot法细胞中β-catenin、P-gp及COX-2的mRNA和蛋白表达水平。结果:成功建立KDM5A基因表达沉默的SKOV3/DDP细胞株。SKOV3/DDP-KDM5Ai组细胞凋亡率增高,G... 

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1主要试剂与仪器
    1.2细胞株及质粒
    1.3方法
        1.3.1 RT-q PCR检测SKOV3/DDP及SKOV3细胞中KDM5A mRNA表达
        1.3.2 Western blot法检测SKOV3/DDP及SKOV3细胞中KDM5A蛋白表达
        1.3.3 KDM5A基因表达沉默的SKOV3/DDP细胞株的构建
        1.3.4实验分组
        1.3.5流式细胞仪检测3组细胞周期比例和凋亡情况
        1.3.6 CCK-8法检测转染后细胞对顺铂的耐药性
        1.3.7高效液相色谱法检测不同顺铂浓度作用下细胞内药物浓度变化
        1.3.8 RT-PCR法检测细胞中β-catenin、P-gp及COX-2基因表达
        1.3.9 Western blot法检测细胞中β-catenin、P-gp及COX-2蛋白表达
    1.4统计学处理
2 结果
    2.1 RT-q PCR法及Western blot法检测卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV3/DDP及亲本细胞SKOV3中KDM5A表达
    2.2 稳定干扰KDM5A表达的卵巢癌细胞株SK-OV3/DDP-KDM5Ai的构建
        2.2.1最佳干扰KDM5A表达的shRNA的筛选
        2.2.2干扰KDM5A表达的稳转细胞株SKOV3/DDP-KDM5Ai的鉴定
    2.3 转染后3组细胞周期分布及凋亡情况的比较
    2.4 转染后细胞对顺铂耐药性的比较
    2.5 转染后细胞中β-catenin、P-gp及COX-2表达水平
3 讨论
    3.1 KDM5A与肿瘤耐药的关系
    3.2 KDM5A参与卵巢癌耐药的分子机制


【参考文献】：
期刊论文
[1]沉默RBP-2基因对紫杉醇耐药的卵巢上皮性癌细胞系SKOV3/PTX细胞耐药性的影响[J]. 冯同富,王燕,李力,郎雁,熊俊,张元珍.  中华妇产科杂志. 2017 (07)
[2]紫杉醇诱导的卵巢癌耐药细胞株的生物学特性及其保存[J]. 樊蓓,李红霞,吴玉梅,赵群,邓小虹.  肿瘤防治研究. 2015(04)



本文编号：3655603