低剂量节拍化疗对卵巢癌细胞SKOV3血管生成拟态的影响及其机制的探讨

发布时间：2017-05-16 11:02

  本文关键词：低剂量节拍化疗对卵巢癌细胞SKOV3血管生成拟态的影响及其机制的探讨，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)是高侵袭性恶性肿瘤细胞所具有的自我血供的微循环结构。本实验通过对荷人卵巢上皮性癌SKOV3细胞裸鼠异种移植瘤模型行不同模式的顺铂(DDP)化疗获取移植瘤原代细胞,比较接受低剂量节拍化疗(low-dose metronomic chemotherapy,LDM)和最大可耐受剂量化疗(maximum tolerated dose chemotherapy,MTD)后SKOV3移植瘤原代细胞形成VM的能力、增殖力及侵袭力,同时分析不同化疗模式对干细胞标记物CD133、ALDH1蛋白表达的影响,并比较CD133+ALDH1+和CD133-ALDH1-细胞形成血管生成拟态的差异,以探讨不同模式化疗对卵巢癌SKOV3细胞形成VM的影响及其可能机制。方法:1建立裸鼠移植瘤模型并分组化疗:体外培养SKOV3细胞,将1×107个细胞接种于雌性裸鼠右侧的大腿皮下,建立裸鼠异种移植瘤模型。2周后选取30只荷瘤裸鼠随机分成三组:LDM组给予DDP1mg/kg腹腔注射,每日1次,共18次;MTD组给予DDP3mg/kg腹腔注射,每3日1次,共6次;对照组给与等量生理盐水腹腔注射,每日1次,共18次。2制备并培养肿瘤原代细胞:化疗结束后3-7天分批处死裸鼠,剥出肿瘤经胶原酶消化、研磨、过滤、离心、洗涤,制得单细胞悬液,常规培养72小时后获得肿瘤原代细胞。3三维细胞培养(three-dimensional cell culture,3DCC)观察比较细胞形成VM的能力:将三组原代细胞的单细胞悬液调整密度至5×104个/ml,接种到3DCC模型,利用倒置显微镜连续动态观察VM开始形成的时间和最终形成密度,并计数血管生成拟态密度(vasculogenic mimicry density,VMD)。实验重复3次,并拍照记录。4 MTT实验检测三组原代细胞的增殖能力。5利用Transwell小室侵袭实验检测三组原代细胞的侵袭力。6采用Westernblot法检测三组原代细胞中CD133、ALDH1蛋白的表达情况。7流式细胞分选(Fluorescence-activated cell sorting,FACS)分选细胞:培养MTD组原代细胞至足够数量,使用CD133、ALDH1抗体依次标记原代细胞,采用FACS分离获得两群细胞:荧光表达较强的细胞群为CD133+ALDH1+细胞,荧光表达较弱的细胞群为CD133-ALDH1-细胞。8 3DCC观察比较形成VM的差异:将分选得到的CD133+ALDH1+细胞以5×104个/ml的密度,CD133-ALDH1-细胞以5×104个/ml和1×105个/ml的密度,分别接种到3DCC模型培养并观察比较其形成VM的不同。9统计学方法:实验数据采用SPSS 17.0统计软件进行统计,计量资料以均数±标准差表示;多组间比较采用单因素方差分析,方差齐时多重比较采用S-N-K法;方差不齐时采用Dunnett’s T3法。以α=0.05为检验水准,当P0.05时,差异有统计学意义;当P0.05时,差异无统计学意义。结果:1 LDM较MTD模式化疗更明显的抑制SKOV3原代细胞在3DCC模型中VM的形成。3DCC比较三组原代细胞形成VM能力,连续动态观察形成VM情况,记录最初形成VM的时间:MTD组6小时,对照组9小时,LDM组12小时;接种后48小时形成VM数量不再变化,计数VMD:MTD组27.60±9.55个/视野,对照组18.67±4.97个/视野,LDM组11.20±2.59个/视野,三组的VMD差异具有统计学意义(F=24.761;P=0.000)。2 LDM较MTD模式化疗可明显抑制SKOV3原代细胞的增殖能力。MTT检测不同化疗模式对原代细胞增殖的影响。MTT生长曲线表明从第3天开始MTD组高于对照组和LDM组(F=5.738;P=0.018);S-N-K多重比较结果显示:对照组和LDM组至第5天增殖差异仍无统计学意义(P=0.853)。3 MTD模式化疗提升原代细胞侵袭力,LDM模式化疗则降低其侵袭力。Transwell小室侵袭实验结果表明:MTD组细胞穿膜数为(156.93±22.77),对照组为(112.13±16.59),LDM组为(87.33±19.58),三组间差异均有统计学意义(F=47.570;P=0.000)。4 MTD模式化疗可使SKOV3原代细胞中肿瘤干细胞标记物CD133、ALDH1蛋白的表达水平上升。Westernblot检测结果提示:三组间CD133蛋白表达水平差异有统计学意义(F=8.251;P=0.006),S-N-K多重比较结果表明对照组和LDM组之间总体均数差异没有统计学意义(P=0.137);三组间ALDH1蛋白表达水平差异有统计学意义(F=67.323;P=0.000),对照组和LDM组之间总体均数差异没有统计学意义(P=0.517)。5 FCAS结果因Westernblot结果提示MTD组CD133、ALDH1蛋白表达水平较对照组和LDM组显著升高,故培养MTD组细胞至足够数量后进行分选,分选采用CD133抗体和ALDH1抗体的双重标记。读取FCAS结果:CD133+ALDH1+所占比例约为1.82%,CD133-ALDH1-所占比例约为79.25%。6低密度的CD133+ALDH1+细胞在6小时即可形成大量VM,而高密度CD133-ALDH1-细胞24小时仅能形成少量VM。将FCAS分选所得细胞以5×104个/ml的密度接种时,CD133+ALDH1+细胞6小时左右形成VM,CD133-ALDH1-细胞48小时仍未形成VM;以1×105个/ml的密度接种CD133-ALDH1-细胞24小时仅形成少量VM。结论:1在累计药物剂量相同的情况下,经MTD模式化疗的SKOV3肿瘤原代细胞比经LDM模式化疗的具有更强的VM形成能力、增殖力及侵袭力。2经MTD化疗后原代细胞中肿瘤干细胞标记物CD133、ALDH1蛋白的表达水平升高,提示传统的MTD化疗模式可富集具有肿瘤干细胞特性的细胞,这些细胞可能会影响肿瘤的血供并导致其不良预后。相对而言,LDM模式较少富集肿瘤干细胞,可能会较MTD模式化疗更为有效和减少复发。
【关键词】：卵巢上皮性癌 低剂量节拍化疗 最大可耐受剂量化疗 血管生成拟态 三维立体培养 流式细胞分选
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文缩写11-12
• 前言12-13
• 材料与方法13-26
• 结果26-28
• 附图28-35
• 附表35-37
• 讨论37-39
• 结论39-40
• 参考文献40-42
• 综述 肿瘤血管生成及抗肿瘤血管生成治疗现状42-51
• 参考文献46-51
• 致谢51-52
• 个人简历52

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本文编号：370626