蜕膜中DDIT4功能紊乱参与子痫前期发病机制的研究

发布时间：2023-02-25 16:19

　　子痫前期(Preeclampsia,PE)是一种人类特有的、原因未知、特发于怀孕20周之后的妊娠期高血压疾病。这种严重的妊娠期并发症影响着全世界约3%-5%的孕妇。然而,其发病机制尚不明确。蜕膜化不足被认为是子痫前期发病机制之一。DDIT4基因编码一种蛋白,这种蛋白的主要功能是在压力或应激作用下抑制mTOR信号通路。有研究证明,DDIT4可促进肿瘤细胞凋亡。我们之前的RNA-Seq结果表明DDIT4在子痫前期妇女蜕膜中的表达量明显降低,因此,我们想要探究DDIT4在人类蜕膜化中的作用及其与子痫前期的关系。最终结果表明,与正常妊娠妇女相比,DDIT4在重度子痫前期蜕膜中表达量明显下降,而在人工诱导蜕膜化模型中,无论是在子宫内膜基质细胞系还是原代子宫内膜基质细胞中,其表达量都明显升高。在上述两种细胞中使用小干扰RNA敲低DDIT4之后引起蜕膜化标志分子如IGFBP1和PRL的表达量明显下降,此外,敲低DDIT4之后会导致磷酸化mTOR和磷酸化p70s6k的上调及凋亡的减少。然而,雷帕霉素,一种mTOR抑制剂,可逆转凋亡的变化。最后,我们发现重度子痫前期蜕膜中剪切型caspase 3的表达量...

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【学位级别】：硕士

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中文摘要
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绪论
1 前言
2 材料方法
    2.1 研究对象
    2.2 实验仪器及试剂
        2.2.1 实验仪器
        2.2.2 实验试剂
        2.2.3 常用溶剂的配置
    2.3 标本采集
    2.4 Real-time PCR
        2.4.1 组织中RNA的提取
        2.4.2 细胞RNA提取
        2.4.3 RNA质检
        2.4.4 RNA浓度测定
        2.4.5 RNA逆转录
        2.4.6 Real-time PCR
    2.5 免疫组织化学
    2.6 免疫荧光
    2.7 蛋白免疫组织印记
        2.7.1 组织处理
        2.7.2 蛋白提取以及定量
        2.7.3 蛋白样品定量测定
        2.7.4 Western Blot
        2.7.5 蛋白条带结果分析
    2.8 细胞培养及蜕膜化
        2.8.1 复苏细胞
        2.8.2 细胞换液
        2.8.3 细胞传代
        2.8.4 细胞冻存
        2.8.5 体外诱导蜕膜化
    2.9 干扰
        2.9.1 干扰引物序列
        2.9.2 干扰操作步骤
    2.10 原代细胞提取
        2.10.1 原代子宫内膜基质细胞的收取
        2.10.2 原代子宫内膜基质细胞的分离提取
        2.10.3 原代子宫内膜基质细胞的纯度鉴定
    2.11 流式
        2.11.1 细胞处理
        2.11.2 流式细胞仪分析
        2.11.3 注意事项
    2.12 统计分析
3 结果
    3.1 研究对象的临床特征
    3.2 DDIT4在SPE和 NP蜕膜组织中的表达及定位
        3.2.1 Real-time PCR结果
        3.2.2 Western Blot结果
        3.2.3 免疫组织化学结果
    3.3 DDIT4 在蜕膜化hESCs和原代hESCs中的表达
        3.3.1 细胞在体外诱导蜕膜化的细胞形态
        3.3.2 DDIT4的mRNA及蛋白水平在诱导蜕膜化后的变化
    3.4 蜕膜化抑制mTOR信号通路,诱导凋亡
        3.4.1 蜕膜化对mTOR通路的影响
        3.4.2 蜕膜化对凋亡的影响
        3.4.3 蜕膜化对增殖的影响
    3.5 干扰DDIT4 影响蜕膜化和凋亡
        3.5.1 干扰DDIT4 后蜕膜细胞的形态变化及PRL、IGFBP1 的变化
        3.5.2 干扰DDIT4后mTOR信号通路上相关蛋白的变化
        3.5.3 干扰DDIT4 后蜕膜细胞凋亡的变化
        3.5.4 干扰DDIT4 后蜕膜细胞增殖的变化
    3.6 DDIT4 通过mTOR通路调控凋亡
        3.6.1 Western Blot结果
        3.6.2 流式细胞仪结果
    3.7 Cleaved-caspase3 在蜕膜组织中的表达
4 讨论
5 结论
参考文献
致谢
硕士期间发表的论文



本文编号：3748782