GRSF1介导miR-G-1通过上调TMED5和LMNB1促进宫颈癌细胞的恶性行为及核自噬
发布时间：2023-02-25 21:04
[研究目的]GRSF1被确认为是一个高峰度含“G”的RNA靶定蛋白,其在包括RNA的转运和定位,RNA的稳定性,RNA剪切转录后调控的许多步骤中起着非常重要的作用,主要是以序列和结构特异的形式通过RNA结合域靶定特定的mRNAs来发挥其功能。最近有研究者报道,GRSF1能够与Inc-RMRP互作并可以促使Inc-RMRP定位在线粒体基质;而,Inc-RMRP是RNase MRP复合体非常重要的一个组分,并且参与酵母核糖体RNA的加工过程;这就意味着说,GRSF1可以介导非编码RNA调控核糖体RNA的加工及合成过程。我们前期的工作也已经证明GRSF1可以介导非编码小RNA,miR-346,促进其靶基因hTERT的表达并且不依赖AG02的存在;这也将为非编码小RNA上调其靶基因提供了一种新的思路。因此,本篇论文旨在探究,GRSF1介导miRNAs上调其靶基因是否存在一定的普遍性。[研究方法]我们首先用F1ag-GRSF1-RIP实验结合深度测序技术检测了Flag-GRSF1复合体中富集的一些非编码小RNAs(miRNAs),用RT-qPCR实验验证了这些富集的miRNAs的表达情况。结合测...
【文章页数】：136 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
缩略语
前言
研究现状、成果
研究目的、方法
一、分析并验证Flag-GRSF1免疫共沉淀-深度测序复合体中富集的新的miRNAs
1.1 材料和方法
1.1.1 实验材料
1.1.2 实验方法
1.1.3 统计学处理方法
1.2 结果
1.2.1 RIP实验提取的复合物中RNA的质量结果
1.2.2 热图分析RIP实验复合物高通量测序结果
1.2.3 在深度测序结果中分析新的miRNAs碱基序列分布
1.2.4 GO和KEGG软件分析高通量测序结果中新的miRNAs靶基因分布情况
1.3 讨论
1.4 小结
二、实验验证未知miRNAs的存在性及解析miR-G-1的表达
2.1 材料和方法
2.1.1 实验材料
2.1.2 实验方法
2.1.3 统计学处理方法
2.2 结果
2.2.1 12个新的miRNAs在HeLa细胞中的分布
2.2.2 生物学软件结合测序结果预测miR-G-1的前体结果及成熟提序列
2.2.3 Northernblot验证miR-G-1的存在
2.2.4 HeLa和S12中检测miR-G-1-3p和miR-G-1-5p的表达水平
2.2.5 不同肿瘤细胞系中miR-G-1-5p的表达水平
2.2.6 宫颈癌患者的血清样本及组织样本中miR-G-1-5p的表达水平
2.3 讨论
2.4 小结
三、miR-G-1作为促癌基因在宫颈癌细胞中发挥着重要作用
3.1 材料与方法
3.1.1 实验材料
3.1.2 实验方法
3.1.3 统计学处理方法
3.2 结果
3.2.1 过表达质粒pri-miR-G-1和敲降质粒Anti-miR-G-1的有效性
3.2.2 miR-G-1促进宫颈癌细胞的生长活性
3.2.3 miR-G-1促进HeLa和C33A细胞的集落形成能力
3.2.4 miR-G-1促进宫颈癌细胞的EdU嵌合率
3.2.5 miR-G-1促进宫颈癌细胞的周期进程
3.2.6 miR-G-1抑制了Hela和C33A细胞的细胞凋亡
3.2.7 miR-G-1抑制宫颈癌细胞的失巢凋亡
3.2.8 miR-G-1加快EMT过程
3.2.9 miR-G-1促进宫颈癌细胞的细胞核自噬行为
3.3 讨论
3.4 小结
四、miR-G-1靶基因的预测和确定
4.1 材料与方法
4.1.1 实验材料
4.1.2 miR-G-1候选靶基因的筛选
4.1.3 统计学处理方法
4.2 结果
4.2.1 生物信息学软件预测miR-G-1的靶基因
4.2.2 荧光报告系统实验验证miR-G-1对预测候选靶基因的直接靶定作用
4.2.3 荧光报告载体的Westernblot实验验证TMED5和LMNB1是miR-G-1的直接靶基因
4.2.4 miR-G-1上调LMNB1和TMED5 mRNA的表达水平
4.2.5 miR-G-1上调靶基因LMNB1和TMED5蛋白的表达
4.2.6 miR-G-1在体内能促进LMNB1和TMED5的表达
4.3 讨论
4.4 小结
五、TMED5在宫颈癌细胞中所起的作用
5.1 实验材料与实验方法
5.1.1 实验材料
5.1.2 实验方法
5.1.3 统计学处理方法
5.2 结果
5.2.1 pTMED5和shR-TMED5质粒的有效性验证
5.2.2 TMED5对HeLa和C33A细胞生长活性的影响
5.2.3 TMED5对HeLa和C33A细胞增殖能力的影响
5.2.4 TMED5促进HeLa和C33A细胞周期G1期向S/G2期的转换
5.2.5 TMED5抑制HeLa和C33A细胞的凋亡
5.2.6 TMED5促进宫颈癌细胞的迁移侵袭能力…
5.2.7 TMED5促进HeLa细胞的上皮-间质转化过程
5.2.8 TMED5的表达量与宫颈癌患者的恶性程度相关
5.3 讨论
5.4 小结
六、TMED5和WNT7B相互作用调控WNT信号通路
6.1 材料与方法
6.1.1 实验材料
6.1.2 实验方法
6.2 实验结果
6.2.1 STRING预测TMED5的相互作用蛋白
6.2.2 免疫荧光实验分析TMED5和WNT7B在细胞内的分布情况
6.2.3 免疫共沉淀实验验证TMED5和WNT7B的相互作用
6.2.4 TMED5能够促进WNT7B的表达
6.2.5 免疫荧光实验检测β-catenin的分布及表达量
6.2.6 TMED5对WNT信号通路相关蛋白的影响
6.2.7 TMED5对TOP/FOP报告系统活性的影响
6.3 讨论
6.4 小结
七.miR-G-1通过LMNB1调控宫颈癌细胞的核自噬行为进而影响了DNA损伤复
7.1 材料与方法
7.1.1 实验材料
7.1.2 实验方法
7.1.3 统计学处理方法实验
7.2 结果
7.2.1 免疫荧光检测LMNB1对HeLa细胞核自噬行为的影响
7.2.2 Westernblot实验检测LMNB1对自噬相关蛋白的影响
7.2.3 LMNB1对DNA损伤修复相关基因的影响
7.3 讨论
7.4 小结
八.GRSF1介导miR-G-1上调其靶基因TMED5和LMNB1
8.1 材料与方法
8.1.2 实验方法
8.2 实验结果
8.2.1 GRSF1介导miR-G-1上调TMED5和LMNB1
8.2.2 shR-GRSF1在HeLa细胞的敲降效率
8.2.3 敲降GRSF1的HeLa细胞中荧光报告基因系统中EGFP的表达….….
8.2.4 我们构建并验证GRSF1的4个分片段的有效性
8.2.5 EMSA检测GRSF1与miR-G-1的结合
8.2.6 EMSA检测GRSF1的4个分片段与miR-G-1的结合
8.3 讨论
8.4 小结
全文结论
本文创新点
参考文献
发表论文和参加科研情况说明
综述 非编码小RNA调控其靶基因表达的分子机制及自噬行为的研究进展
综述参考文献
致谢
个人简历
本文编号：3749195
【文章页数】：136 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
缩略语
前言
研究现状、成果
研究目的、方法
一、分析并验证Flag-GRSF1免疫共沉淀-深度测序复合体中富集的新的miRNAs
1.1 材料和方法
1.1.1 实验材料
1.1.2 实验方法
1.1.3 统计学处理方法
1.2 结果
1.2.1 RIP实验提取的复合物中RNA的质量结果
1.2.2 热图分析RIP实验复合物高通量测序结果
1.2.3 在深度测序结果中分析新的miRNAs碱基序列分布
1.2.4 GO和KEGG软件分析高通量测序结果中新的miRNAs靶基因分布情况
1.3 讨论
1.4 小结
二、实验验证未知miRNAs的存在性及解析miR-G-1的表达
2.1 材料和方法
2.1.1 实验材料
2.1.2 实验方法
2.1.3 统计学处理方法
2.2 结果
2.2.1 12个新的miRNAs在HeLa细胞中的分布
2.2.2 生物学软件结合测序结果预测miR-G-1的前体结果及成熟提序列
2.2.3 Northernblot验证miR-G-1的存在
2.2.4 HeLa和S12中检测miR-G-1-3p和miR-G-1-5p的表达水平
2.2.5 不同肿瘤细胞系中miR-G-1-5p的表达水平
2.2.6 宫颈癌患者的血清样本及组织样本中miR-G-1-5p的表达水平
2.3 讨论
2.4 小结
三、miR-G-1作为促癌基因在宫颈癌细胞中发挥着重要作用
3.1 材料与方法
3.1.1 实验材料
3.1.2 实验方法
3.1.3 统计学处理方法
3.2 结果
3.2.1 过表达质粒pri-miR-G-1和敲降质粒Anti-miR-G-1的有效性
3.2.2 miR-G-1促进宫颈癌细胞的生长活性
3.2.3 miR-G-1促进HeLa和C33A细胞的集落形成能力
3.2.4 miR-G-1促进宫颈癌细胞的EdU嵌合率
3.2.5 miR-G-1促进宫颈癌细胞的周期进程
3.2.6 miR-G-1抑制了Hela和C33A细胞的细胞凋亡
3.2.7 miR-G-1抑制宫颈癌细胞的失巢凋亡
3.2.8 miR-G-1加快EMT过程
3.2.9 miR-G-1促进宫颈癌细胞的细胞核自噬行为
3.3 讨论
3.4 小结
四、miR-G-1靶基因的预测和确定
4.1 材料与方法
4.1.1 实验材料
4.1.2 miR-G-1候选靶基因的筛选
4.1.3 统计学处理方法
4.2 结果
4.2.1 生物信息学软件预测miR-G-1的靶基因
4.2.2 荧光报告系统实验验证miR-G-1对预测候选靶基因的直接靶定作用
4.2.3 荧光报告载体的Westernblot实验验证TMED5和LMNB1是miR-G-1的直接靶基因
4.2.4 miR-G-1上调LMNB1和TMED5 mRNA的表达水平
4.2.5 miR-G-1上调靶基因LMNB1和TMED5蛋白的表达
4.2.6 miR-G-1在体内能促进LMNB1和TMED5的表达
4.3 讨论
4.4 小结
五、TMED5在宫颈癌细胞中所起的作用
5.1 实验材料与实验方法
5.1.1 实验材料
5.1.2 实验方法
5.1.3 统计学处理方法
5.2 结果
5.2.1 pTMED5和shR-TMED5质粒的有效性验证
5.2.2 TMED5对HeLa和C33A细胞生长活性的影响
5.2.3 TMED5对HeLa和C33A细胞增殖能力的影响
5.2.4 TMED5促进HeLa和C33A细胞周期G1期向S/G2期的转换
5.2.5 TMED5抑制HeLa和C33A细胞的凋亡
5.2.6 TMED5促进宫颈癌细胞的迁移侵袭能力…
5.2.7 TMED5促进HeLa细胞的上皮-间质转化过程
5.2.8 TMED5的表达量与宫颈癌患者的恶性程度相关
5.3 讨论
5.4 小结
六、TMED5和WNT7B相互作用调控WNT信号通路
6.1 材料与方法
6.1.1 实验材料
6.1.2 实验方法
6.2 实验结果
6.2.1 STRING预测TMED5的相互作用蛋白
6.2.2 免疫荧光实验分析TMED5和WNT7B在细胞内的分布情况
6.2.3 免疫共沉淀实验验证TMED5和WNT7B的相互作用
6.2.4 TMED5能够促进WNT7B的表达
6.2.5 免疫荧光实验检测β-catenin的分布及表达量
6.2.6 TMED5对WNT信号通路相关蛋白的影响
6.2.7 TMED5对TOP/FOP报告系统活性的影响
6.3 讨论
6.4 小结
七.miR-G-1通过LMNB1调控宫颈癌细胞的核自噬行为进而影响了DNA损伤复
7.1 材料与方法
7.1.1 实验材料
7.1.2 实验方法
7.1.3 统计学处理方法实验
7.2 结果
7.2.1 免疫荧光检测LMNB1对HeLa细胞核自噬行为的影响
7.2.2 Westernblot实验检测LMNB1对自噬相关蛋白的影响
7.2.3 LMNB1对DNA损伤修复相关基因的影响
7.3 讨论
7.4 小结
八.GRSF1介导miR-G-1上调其靶基因TMED5和LMNB1
8.1 材料与方法
8.1.2 实验方法
8.2 实验结果
8.2.1 GRSF1介导miR-G-1上调TMED5和LMNB1
8.2.2 shR-GRSF1在HeLa细胞的敲降效率
8.2.3 敲降GRSF1的HeLa细胞中荧光报告基因系统中EGFP的表达….….
8.2.4 我们构建并验证GRSF1的4个分片段的有效性
8.2.5 EMSA检测GRSF1与miR-G-1的结合
8.2.6 EMSA检测GRSF1的4个分片段与miR-G-1的结合
8.3 讨论
8.4 小结
全文结论
本文创新点
参考文献
发表论文和参加科研情况说明
综述 非编码小RNA调控其靶基因表达的分子机制及自噬行为的研究进展
综述参考文献
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本文编号：3749195
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/fuchankeerkelunwen/3749195.html
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