MicroRNA-28-5p对PCOS大鼠卵巢颗粒细胞功能调控的分子机制实验研究

发布时间：2023-04-20 02:40

　　目的多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)是育龄期女性常见的内分泌紊乱疾病,但目前发病机制尚不明确。MicroRNA(miRNA)是一类非编码单链RNA,可调控基因转录后表达。DNA甲基化是影响miRNA表达的重要机制之一。研究发现,miRNA表达异常参与PCOS相关病理改变。本实验检测卵巢颗粒细胞miRNA-28-5p及其可能靶基因PROK1表达,并检测miRNA-28-5p甲基化改变和miRNA-28-5p/PROK1信号轴对颗粒细胞功能的影响及其细胞信号传导通路,旨在为miRNA-28-5p在PCOS疾病的早期诊断以及治疗等方面的临床应用提供理论依据。方法建造PCOS大鼠模型,qRT-PCR检测正常组和PCOS组卵巢颗粒细胞miRNA-28-5p表达,MSP检测miRNA-28-5p启动子甲基化状态,CCK-8,EDU染色,流式细胞仪和Western blot实验检测5-Aza-CdR处理对颗粒细胞增生和凋亡的影响。之后,生物分析软件筛选miRNA-28-5p的可能靶基因PROK1。qRT-PCR和Western blot实验检测检测正常组...

【文章页数】：134 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
第一章 PCOS大鼠卵巢颗粒细胞MicroRNA-28-5p甲基化状态的研究
    1.1 实验方法
        1.1.1 实验对象
        1.1.2 实验试剂
        1.1.3 实验器材
        1.1.4 相关试剂配制
        1.1.5 PCOS动物模型构建
        1.1.6 阴道涂片检测
        1.1.7 标本采集与处理
        1.1.8 卵巢组织H&E染色
        1.1.9 大鼠总睾酮(TT)和性激素结合蛋白(SHBG)检测
        1.1.10 细胞培养
        1.1.11 免疫荧光鉴定
        1.1.12 5-Aza-CdR处理细胞
        1.1.13 实时荧光定量PCR
        1.1.14 甲基化特异性PCR (MSP)实验
        1.1.15 miRNA-28-5p抑制剂转染
        1.1.16 CCK-8实验
        1.1.17 Edu实验
        1.1.18 流式细胞仪检测细胞凋亡
        1.1.19 流式细胞仪检测细胞周期
        1.1.20 Wetern blot实验
        1.1.21 统计分析
    1.2 实验结果
        1.2.1 大鼠体重称量结果
        1.2.2 大鼠阴道涂片结果
        1.2.3 卵巢组织形态学观察
        1.2.4 大鼠总睾酮(TT)和性激素结合蛋白(SHBG)检测结果
        1.2.5 建模成功率
        1.2.6 大鼠卵巢颗粒细胞的观察
        1.2.7 大鼠卵巢颗粒细胞的鉴定
        1.2.8 颗粒细胞miRNA-28-5p的表达
        1.2.9 颗粒细胞miRNA-28-5p的甲基化状态
        1.2.10 甲基化抑制剂对颗粒细胞miRNA-28-5p表达的影响
        1.2.11 甲基化抑制剂对颗粒细胞miRNA-28-5p甲基化状态的影响
        1.2.12 CCK-8实验检测PCOS大鼠卵巢颗粒细胞活性
        1.2.13 EdU染色流式细胞仪检测PCOS大鼠卵巢颗粒细胞增殖
        1.2.14 流式细胞仪检测PCOS大鼠卵巢颗粒细胞凋亡
        1.2.15 流式细胞仪检测PCOS大鼠卵巢颗粒细胞周期阻滞
        1.2.16 Western blot实验检测凋亡和细胞周期相关蛋白表达
    1.3 小结
    1.4 讨论
第二章 MicroRNA-28-5p/PROK1信号轴对PCOS卵巢颗粒细胞功能调控的分子机制研究
    2.1 实验方法
        2.1.1 实验试剂
        2.1.2 实验器材
        2.1.3 筛选miRNA-28-5p靶基因
        2.1.4 miRNA-28-5p mimics转染
        2.1.5 实时荧光定量PCR
        2.1.6 双荧光素酶报告基因
        2.1.7 PROK1过表达载体构建
        2.1.8 PROK1过表达载体转染
        2.1.9 CCK-8实验
        2.1.10 EdU实验
        2.1.11 流式细胞仪检测细胞凋亡
        2.1.12 流式细胞仪检测细胞周期
        2.1.13 Wetern blot实验
        2.1.14 统计分析
    2.2 实验结果
        2.2.1 筛选miRNA-28-5p靶基因
        2.2.2 颗粒细胞PROK1的表达
        2.2.3 miRNA-28-5p对PROK1的调控作用
        2.2.4 PROK1野生型载体(psiCHECK-2-PROK1-WT)的鉴定
        2.2.5 PROK1突变型载体(psiCHECK-2-PROK1-MUT)的鉴定
        2.2.6 双荧光素酶报告基因
        2.2.7 PROK1过表达载体(pcDNA3.0-PROK1)的鉴定
        2.2.8 PROK1过表达载体(pcDNA3.0-PROK1)转染的鉴定
        2.2.9 CCK-8实验检测大鼠卵巢颗粒细胞活性
        2.2.10 EdU染色流式细胞仪检测大鼠卵巢颗粒细胞增殖
        2.2.11 流式细胞仪检测大鼠卵巢颗粒细胞凋亡
        2.2.12 流式细胞仪检测PCOS大鼠卵巢颗粒细胞周期阻滞
        2.2.13 Western blot实验检测凋亡和细胞周期相关蛋白表达
        2.2.14 Western blot实验检测PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达
    2.3 小结
    2.4 讨论
参考文献
攻读学位期间成果
缩略词
致谢



本文编号：3794722